Kit de fitodiagnóstico PCR. Diagnóstico de doenças dos relvados por microscopia e reação em cadeia da polimerase (PCR).

Este artigo fornece uma visão sobre a metodologia de diagnóstico das doenças dos relvados, analisando a eficácia da Kit de diagnóstico fitossanitário PCR de Tiloom. O estudo analisou o azevém perene infetado de um campo desportivo na Clube de Futebol de Leicester por microscopia e por uma técnica molecular. O processo começou com inspecções visuais no campo e microscopia, tendo a análise sido concluída por PCR quantitativa em tempo real. Como resultado, foram excluídos 11 agentes patogénicos comuns da estação fria, com quatro identificações positivas em vários níveis de infeção, desde positivo fraco a positivo forte. As conclusões destes métodos são discutidas abaixo.

Fundo da superfície do relvado desportivo. 

A relva de azevém perene 100 % em estudo foi ceifada várias vezes por semana a 25 mm (atual). Na semana anterior, foram aplicados cerca de 50 kg de N/ha, 15 kg de P/ha, 45 kg de K/ha com um aminoácido e algas. Este campo foi sujeito a cerca de 6 horas de treino de futebol por semana.

Análise microscópica

Um local de infeção. Lesão causada pelo cortador de relva no azevém perene na parte inferior da folha.

Infeção e morte do azevém de folhas cortadas ao microscópio de dissecação. As lesões causadas pelo corte de relva parecem ser um local de morte e de infeção. O escurecimento e o amarelecimento indicam sinais de material foliar infetado.

Foram observadas folhas amareladas e retorcidas em várias das folhas de azevém perene inspeccionadas. Mais evidente foi a morte das folhas a partir da ponta com estruturas cinzento-esbranquiçadas em folhas moribundas, murchas e torcidas de azevém perene.

Ao microscópio ótico, as estruturas filamentosas foram observadas mais de perto.

Foi observada uma infeção bacteriana filamentosa nas folhas de azevém perene, corada a 40x para visibilidade.

Filamentos bacterianos coradas a 25x com azul de anilina para exibição dentro da folha de azevém sempre verde. O bactérias filamentosas não se ramificou e correu longitudinalmente ao longo do comprimento da folha. 

Bactérias filamentosas a 40x coradas com azul de anilina numa folha de azevém perene. As bactérias agregadas não são ramificadas e não têm partições aparentes (secções/paredes divisórias).

Numa planta diferente dentro da área amostrada, sob um microscópio de dissecação, é visível o micélio cotonoso a sobressair do material foliar moribundo do azevém perene.

Hifas ramificadas, coradas a azul num microscópio de luz de 25x.

Hifas ramificadas de coloração azul no azevém perene; infelizmente, foi observada uma ramificação em forma de T ligeiramente desfocada.

Resultados da microscopia

O trabalho de microscopia ótica identificou uma infeção bacteriana filamentosa potencialmente comum, por exemplo, possivelmente os primeiros sinais de uma cianobactérias (infeção por algas). Numa planta diferente da mesma amostra, o micélio protuberante foi observado mais de perto com ramificações observáveis na forma de um T. Característica de Rhizoctonia spp. Só com uma análise molecular mais aprofundada é que este facto poderá ser elucidado. 

Análise de ADN

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica molecular que pode ser utilizada para detetar a presença de ADN alvo. É muito precisa e a deteção pode ser identificada em quantidades muito pequenas. Atualmente, utilizamos esta técnica para identificar a presença de agentes patogénicos nas plantas/gramíneas. Estes agentes patogénicos podem ser fúngicos ou não fúngicos (por exemplo, bactérias). O modelo de ADN alvo (conhecido como iniciador ou tampão) é necessário para a amplificação do ADN. Este método utiliza múltiplos primers de ADN na PCR. Este método é conhecido como PCR multiplex.

Os agentes patogénicos de ADN testados incluíam: Bipolaris spp, Clarireedia spp, Colletotrichum spp., Drechslera spp., Fusarium poesia , Gaeumannomyces spp, Laetisaria fuciformis , Microdochium nivale , Pyricularia grisea , Pythium spp, Rhizoctonia cerealis , R. solani , Sclerophthora macrospora. , Xanthomonas translucens , Labirinto spp. 

Ou vulgarmente conhecida como: Mancha da folha (Bipolaris & Dreschlera spp), mancha do dólar, antracnose, Fusarium, mancha de mal murcho, rosca vermelha, mancha de Microdochium, mancha cinzenta da folha, Pythium (amortecimento), mancha amarela, mancha castanha, tufo amarelo (míldio), murcha bacteriana, míldio rápido(sujidade rápida). 

Foram colhidas amostras de seis plantas de azevém perene, que foram preparadas para posterior análise forense por reação em cadeia da polimerase (PCR).

O material das folhas, rebentos e raízes do azevém perene foi cortado e homogeneizado para análise.

O passo inicial da extração de ADN foi a decomposição das células das folhas, dos rebentos e das raízes.

O concentrado de ADN extraído da planta e do agente patogénico.

O ADN extraído foi lavado e eluído em preparação para a amplificação do ADN por PCR.

Microtubos contendo solução de reação PCR para os 15 agentes patogénicos com controlo de amplificação.

Quatro agentes patogénicos foram detectados positivamente por PCR quantitativo em tempo real: Microdochium nivale (mancha de Fusarium), Pythium spp. (amortecimento), Rhizoctonia solani (mancha castanha) e R. cerealis (mancha amarela). Foi detectado um elevado nível de R. cerealis.

Resultados da PCR

Como o ADN aqui analisado não incluía Cianobactérias spp. não foi possível confirmar a sua presença. No entanto, esta técnica de PCR multiplex excluiu 11 outros agentes patogénicos dos relvados amostrados. Embora não houvesse sintomas óbvios de doença que pudessem ser associados ao Microdochium/Fusarium Patch ( Microdochium nivale ) o Pythium hifas características do Yellow Patch ( Rhizoctonia cerealis ) ou Brown Patch ( R. solani ) na altura da amostragem. A análise do ADN forneceu provas da sua presença. Curiosamente, suspeitava-se que a doença da mancha amarela fosse a causa das manchas no verão e no outono anteriores (julho-outubro) de 2021 e 2023. Sabe-se que rizoctonia hibernam no interior da erva ou dos resíduos vegetais. Uma vez que a amostra de azevém incluía folhas, raízes, rebentos e material foliar decomposto, é provável que a reação incluísse fungos que hibernam.

Sintomas típicos da infeção pela mancha amarela que ocorrem nos meses de verão de 2022 e 2023 (esta fotografia é de agosto de 2023) no local.

Recomendações

É importante notar que foram identificados vários agentes patogénicos nestas amostras. Normalmente, damos o nome e discutimos uma doença quando observamos sinais e sintomas no relvado. Neste caso, estão envolvidos pelo menos quatro ou cinco agentes patogénicos. Os agentes patogénicos identificados podem ter causado amarelecimento e morte com infeção bacteriana secundária. Isto é possivelmente típico, e a interação entre estes agentes patogénicos e outras doenças como as algas está a ter um efeito combinado no estado da relva; isto provavelmente requer mais investigação.

As recomendações para controlar estas ameaças à saúde e ao estado dos relvados incluem uma análise das abordagens biológicas e físicas. Por exemplo, sabe-se que certas espécies de bactérias Bacilo controlo Rhizoctonia . Existe uma gama de produtos disponíveis no mercado dos relvados. Uma intervenção precoce nesta altura pode ter maior eficácia, como é habitual nos controlos biológicos. Para a infeção por cianobactérias é efectuada uma aplicação sequencial de luz UV-C, partindo do princípio de que as algas são sensíveis aos raios UV. A aplicação e a dosagem de azoto e fósforo podem também ser revistas para garantir níveis suficientes. 

O diagnóstico de doenças dos relvados é um passo importante para uma gestão eficiente e eficaz dos relvados. Quer se trate de afetar recursos e orçamentos, ou de agir de forma eficiente e eficaz para proteger o ambiente, mantendo a qualidade das superfícies de jogo. Sabemos que a gestão preventiva de doenças é frequentemente rentável e proporciona superfícies de jogo de boa qualidade. 

Embora a microscopia tenha permitido uma ampla investigação da infeção, não permitiu identificar o agente patogénico exato. A inspeção microscópica constituiu uma oportunidade para investigar os locais de infeção e observar quaisquer características do fungo patogénico, como demonstrado pelas folhas cortadas danificadas pelo cortador e pelo início da infeção. Este foi um passo inicial importante para investigar a causa provável, caso seja necessária uma identificação exacta. 

A técnica PCR foi precisa na deteção de agentes patogénicos presentes, quer estes agentes estivessem sintomáticos ou infectando latentemente a relva. Pode ter fornecido um indicador quase preditivo de uma possível doença futura. Isto significa que se pode iniciar um plano de tratamento integrado para estes agentes patogénicos específicos e monitorizá-lo continuamente. 

A identificação exacta dos agentes patogénicos na fase sintomática ou dormente é melhor diagnosticada utilizando a microscopia e a análise molecular, como se mostra neste estudo de caso. É provável que estas técnicas forneçam ao gestor de espaços verdes as melhores informações para uma ação imediata e para o planeamento da gestão da doença. Essencialmente, estes parecem ser os melhores primeiros passos para uma gestão proactiva e preventiva integrada das doenças. 

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