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PCR-Phytodiagnose-Kit. Diagnose von Rasenkrankheiten durch Mikroskopie und Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

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Javier Méndez Lorente
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Das Inhaltsverzeichnis: PCR-Phytodiagnose-Kit. Diagnose von Rasenkrankheiten durch Mikroskopie und Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

Dieser Artikel gibt einen Einblick in die Methodik der Diagnose von Rasenkrankheiten und analysiert die Wirksamkeit der PCR-Kit für die Phytodiagnose von Tiloom. In der Studie wurde infiziertes mehrjähriges Weidelgras von einem Sportplatz im Fußballverein Leicester durch Mikroskopie und eine molekulare Technik. Der Prozess begann mit visuellen Inspektionen im Feld und Mikroskopie, die Analyse wurde durch quantitative Echtzeit-PCR abgeschlossen. Im Ergebnis wurden 11 Erreger der Erkältungssaison ausgeschlossen, wobei vier positive Identifizierungen auf verschiedenen Infektionsniveaus, von schwach positiv bis stark positiv, vorlagen. Die Ergebnisse dieser Methoden werden im Folgenden erörtert.

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Unterseite der Sportrasenfläche. 

Der untersuchte 100 % Weidelgrasrasen wurde mehrmals wöchentlich bei 25 mm (aktuell) gemäht. In der Vorwoche wurden etwa 50 kg N/ha, 15 kg P/ha, 45 kg K/ha mit einer Aminosäure und Algen ausgebracht. Auf diesem Feld wurde pro Woche etwa 6 Stunden Fußballtraining durchgeführt.

Mikroskopische Analyse

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Ein Ort der Infektion. Mähschaden an mehrjährigem Weidelgras von der Blattunterseite.

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Infektion und Absterben von immergrünem Weidelgras unter dem Seziermikroskop. Durch das Mähen verursachte Läsionen scheinen ein Ort des Absterbens und der Infektion zu sein. Schwärzung und Vergilbung sind Anzeichen für infiziertes Blattmaterial.

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An mehreren der untersuchten Blätter des immergrünen Weidelgrases wurden Vergilbungen und verdrehte Blätter beobachtet. Deutlicher war das Absterben der Blätter von der Spitze her mit weißlich-grauen Strukturen auf absterbenden, verwelkten und verdrehten Blättern des mehrjährigen Weidelgrases.

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Unter dem Lichtmikroskop konnten die fadenförmigen Strukturen genauer betrachtet werden.

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In den Blättern des mehrjährigen Weidelgrases wurde eine fadenförmige bakterielle Infektion beobachtet, die bei 40-facher Vergrößerung sichtbar wurde.

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Bakterielle Fäden gefärbt bei 25x mit Anilinblau im Inneren des immergrünen Weidelgrasblattes zu sehen. Die fadenförmige Bakterien sich nicht verzweigt hat und läuft in Längsrichtung entlang der Länge des Bogens. 

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Mit Anilinblau gefärbte fadenförmige Bakterien bei 40x in einem mehrjährigen Weidelgrasblatt. Aggregierte Bakterien sind nicht verzweigt und haben keine offensichtlichen Trennwände (Abschnitte/Wände).

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An einer anderen Pflanze innerhalb der beprobten Fläche ist unter dem Seziermikroskop ein watteartiges Myzel zu erkennen, das aus dem absterbenden Blattmaterial des mehrjährigen Weidelgrases herausragt.

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Verzweigte Hyphen, blau gefärbt unter dem 25x-Lichtmikroskop.

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Blau gefärbte verzweigte Hyphen im mehrjährigen Weidelgras; leider wurde eine leicht unscharfe T-förmige Verzweigung beobachtet.

Mikroskopische Ergebnisse

Die lichtmikroskopischen Untersuchungen ergaben, dass es sich möglicherweise um eine häufige bakterielle Fadeninfektion handelt, die möglicherweise erste Anzeichen einer Cyanobakterien (Algeninfektion). An einer anderen Pflanze aus derselben Probe wurde das ausladende Myzel genauer beobachtet, wobei eine Verzweigung in Form eines T zu erkennen war. Rhizoctonia spp. Dies konnte nur durch weitere molekulare Analysen geklärt werden. 

DNA-Analyse

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein molekulares Verfahren, mit dem das Vorhandensein von Ziel-DNA nachgewiesen werden kann. Sie ist sehr genau und der Nachweis kann in sehr kleinen Mengen erfolgen. Wir verwenden diese Technik jetzt, um das Vorhandensein von Krankheitserregern in Pflanzen und Gräsern nachzuweisen. Diese Krankheitserreger können pilzartig oder nicht pilzartig (z. B. bakteriell) sein. Für die DNA-Amplifikation wird die Ziel-DNA-Vorlage (ein so genannter Primer oder Puffer) benötigt. Bei dieser Methode werden mehrere DNA-Primer in der PCR verwendet. Dies wird als Multiplex-PCR bezeichnet.

Zu den getesteten DNA-Erregern gehörten: Bipolaris spp, Klartext spp, Colletotrichum spp., Drechslera spp., Fusarium poae , Gaeumannomyces spp, Laetisaria fuciformis , Microdochium nivale , Pyricularia grisea , Pythium spp, Rhizoctonia cerealis , R. solani , Sclerophthora macrospora. , Xanthomonas translucens , Labyrinthula spp. 

Oder gemeinhin bekannt als: Blattfleck (Bipolaris & Dreschlera spp), dollar spot, antracnosis, Fusarium, take-all patch, red thread (hilo rojo), Microdochium patch, grey leaf spot, Pythium (damping off), yellow patch, brown patch, yellow tuft (mildiu velloso), bacterial wilt (marchitez bacteriana), Rapid blight(tizón rápido). 

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Sechs mehrjährige Weidelgraspflanzen wurden beprobt und für die weitere forensische Analyse mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vorbereitet.

Blatt-, Spross- und Wurzelmaterial des mehrjährigen Weidelgrases wurde geschnitten und für die Analyse homogenisiert.

Der erste Schritt der DNA-Extraktion bestand in der Zersetzung von Zellen aus Blatt-, Spross- und Wurzelmaterial.

Das extrahierte Pflanzen- und Erreger-DNA-Konzentrat.

Die extrahierte DNA wurde gewaschen und eluiert, um die DNA-Amplifikation durch PCR vorzubereiten.

Mikroröhrchen mit PCR-Reaktionslösung für die 15 Krankheitserreger mit Amplifikationskontrolle.

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Vier Krankheitserreger wurden mittels quantitativer Echtzeit-PCR positiv nachgewiesen: Microdochium nivale (Fusarium-Fleck), Pythium spp. (Damping off), Rhizoctonia solani (Braunfleck) und R. cerealis (Gelber Fleck). Es wurde ein hoher Anteil von R. cerealis nachgewiesen.

PCR-Ergebnisse

Da die hier analysierte DNA keine Cyanobakterien spp. war es nicht möglich, ihr Vorhandensein zu bestätigen. Mit dieser Multiplex-PCR-Technik konnten jedoch 11 andere Krankheitserreger von der beprobten Grasnarbe ausgeschlossen werden. Obwohl es keine offensichtlichen Krankheitssymptome gab, die mit Microdochium/Fusarium-Patch in Verbindung gebracht werden konnten ( Microdochium nivale ) o Pythium Hyphen, die für den Gelben Fleck ( Rhizoctonia cerealis ) oder Brauner Fleck ( R. solani ) zum Zeitpunkt der Probenahme. Die DNA-Analyse lieferte den Beweis für sein Vorhandensein. Interessanterweise wurde die Gelbe Fleckenkrankheit als Ursache für die Flecken im vorangegangenen Sommer und Herbst (Juli-Oktober) der Jahre 2021 und 2023 vermutet. Es ist bekannt, dass Rhizoctonia im Gras oder in Pflanzenresten überwintert. Da das beprobte Weidelgras Blätter, Wurzeln, Triebe und zersetztes Blattmaterial enthielt, ist es wahrscheinlich, dass überwinternde Pilze in der Reaktion enthalten waren.

Typische Symptome der Gelbfleckenkrankheit, die in den Sommermonaten 2022 und 2023 (dieses Foto stammt vom August 2023) an dem Standort auftraten.

Empfehlungen

Es ist wichtig zu wissen, dass in diesen Proben mehrere Krankheitserreger nachgewiesen wurden. Normalerweise benennen und diskutieren wir eine Krankheit, wenn wir Anzeichen und Symptome in der Grasnarbe beobachten. In diesem Fall sind mindestens vier oder fünf Krankheitserreger beteiligt. Die identifizierten Krankheitserreger können Vergilbung und Absterben mit einer bakteriellen Sekundärinfektion verursacht haben. Dies ist möglicherweise typisch, und die Wechselwirkung zwischen diesen Krankheitserregern und anderen Störungen wie Algen hat eine kombinierte Wirkung auf den Zustand des Rasens; dies erfordert wahrscheinlich weitere Untersuchungen.

Empfehlungen zur Bekämpfung dieser Bedrohungen für die Gesundheit und den Zustand des Rasens würden eine Überprüfung der biologischen und physikalischen Ansätze beinhalten. Es ist zum Beispiel bekannt, dass bestimmte Arten von Bakterien Bacillus Kontrolle Rhizoctonia . Auf dem Rasenmarkt gibt es eine Reihe von Produkten. Ein frühzeitiges Eingreifen zu diesem Zeitpunkt kann, wie bei biologischen Bekämpfungsmitteln üblich, eine größere Wirksamkeit haben. Bei Infektion durch Cyanobakterien eine sequentielle Anwendung von UV-C-Licht erfolgt, da Algen empfindlich auf UV-Strahlen reagieren. Der Einsatz und die Dosierung von Stickstoff und Phosphor können ebenfalls überprüft werden, um ausreichende Mengen sicherzustellen. 

Die Diagnose von Rasenkrankheiten ist ein wichtiger Schritt für eine effiziente und effektive Rasenbewirtschaftung. Sei es bei der Zuteilung von Ressourcen und Budgets oder beim effizienten und effektiven Handeln, um die Umwelt zu schützen und gleichzeitig hochwertige Spielflächen zu erhalten. Wir wissen, dass ein präventives Krankheitsmanagement oft kosteneffizient ist und eine gute Qualität der Spielflächen gewährleistet. 

Die Mikroskopie ermöglichte zwar eine umfassende Untersuchung der Infektion, konnte aber den genauen Erreger nicht identifizieren. Die mikroskopische Inspektion bot die Möglichkeit, die Infektionsstellen zu untersuchen und alle Merkmale des pathogenen Pilzes zu beobachten, wie sie sich in den durch das Mähwerk beschädigten Schnittblättern und dem Beginn der Infektion zeigten. Dies war ein wichtiger erster Schritt zur Untersuchung der wahrscheinlichen Ursache, falls eine genaue Identifizierung erforderlich sein sollte. 

Mit dem PCR-Verfahren konnten vorhandene Krankheitserreger genau nachgewiesen werden, unabhängig davon, ob diese Krankheitserreger symptomatisch oder latent den Rasen infizieren. Sie kann einen nahezu prädiktiven Indikator für mögliche künftige Krankheiten liefern. Dies bedeutet, dass ein integrierter Behandlungsplan für diese spezifischen Krankheitserreger eingeleitet und kontinuierlich überwacht werden kann. 

Die genaue Identifizierung von Krankheitserregern in der symptomatischen oder ruhenden Phase lässt sich am besten mit Hilfe der Mikroskopie und der Molekularanalyse diagnostizieren, wie in dieser Fallstudie gezeigt. Diese Techniken liefern dem Greenkeeper wahrscheinlich die besten Informationen für Sofortmaßnahmen und die Planung des Krankheitsmanagements. Im Grunde genommen scheinen dies die besten ersten Schritte für ein proaktives und präventives integriertes Krankheitsmanagement zu sein. 

Kontakt zu Tiloom unter info@tiloom.com und in weniger als 48 Stunden haben Sie die Antwort durch einen qPCR-Diagnosetest.

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