Kit de phytodiagnostic PCR. Diagnostic des maladies du gazon par microscopie et réaction en chaîne par polymérase (PCR).

Cet article donne un aperçu de la méthodologie du diagnostic des maladies du gazon, en analysant l'efficacité de la méthode Kit PCR pour le phytodiagnostic de Tiloom. L'étude a analysé du ray-grass vivace infecté provenant d'un terrain de sport de l'université de Tiloom. Leicester Football Club par microscopie et par une technique moléculaire. Le processus a commencé par des inspections visuelles sur le terrain et par la microscopie, l'analyse s'est terminée par une PCR quantitative en temps réel. En conséquence, 11 pathogènes courants de la saison froide ont été écartés, avec quatre identifications positives à différents niveaux d'infection, de faiblement positif à fortement positif. Les résultats de ces méthodes sont présentés ci-dessous.

Fond de la surface de la pelouse sportive. 

El césped 100 % raigrás perenne que se estaba investigando se cortó varias veces por semana a 25 mm (reales). La semana anterior se aplicó alrededor de 50 kg N/ha, 15 Kg P/ha, 45 kg K/ha con un aminoácido y algas. Este campo fue sometido a unas 6 horas de entrenamiento de fútbol por semana.

Analyse au microscope

Site d'infection. Blessure causée par la faucheuse sur l'ivraie vivace à partir de la face inférieure de la feuille.

Infection et dépérissement du ray-grass à feuilles persistantes sous le microscope à dissection. Les lésions causées par le fauchage semblent être un site de dépérissement et d'infection. Le noircissement et le jaunissement indiquent la présence de matériel foliaire infecté.

Un jaunissement et des feuilles tordues ont été observés sur plusieurs des feuilles de ray-grass à feuilles persistantes inspectées. Le dépérissement des feuilles à partir de l'extrémité avec des structures gris blanchâtre sur les feuilles mourantes, flétries et tordues de ray-grass vivace était plus évident.

Au microscope optique, les structures filamenteuses ont été observées de plus près.

Une infection bactérienne filamenteuse colorée 40x pour la visibilité a été observée dans les feuilles de l'ivraie vivace.

Filaments bactériens colorée à 25x avec du bleu d'aniline à l'intérieur de la feuille d'ivraie à feuilles persistantes. Les bactéries filamentosas ne s'est pas ramifié et n'a pas couru longitudinalement sur toute la longueur de la feuille. 

Bactéries filamenteuses colorées au bleu d'aniline à 40x dans une feuille d'ivraie vivace. Les bactéries agrégées ne sont pas ramifiées et ne présentent pas de cloisons apparentes (sections/parois de séparation).

Sur une autre plante de la zone échantillonnée, on peut voir au microscope à dissection un mycélium cotonneux dépassant de la matière foliaire mourante de l'ivraie vivace.

Hyphes ramifiés, colorés en bleu au microscope optique 25x.

Hyphes ramifiés colorés en bleu dans l'ivraie vivace ; malheureusement, une ramification en forme de T légèrement non focalisée a été observée.

Résultats de la microscopie

Les travaux de microscopie optique ont permis d'identifier une infection bactérienne filamenteuse potentiellement commune, par exemple des signes précoces d'une maladie infectieuse. cyanobactéries (infection par les algues). Sur une autre plante du même échantillon, le mycélium saillant a été observé de plus près avec des ramifications observables en forme de T. Caractéristique des Rhizoctone spp. Seule une analyse moléculaire plus poussée permettrait de l'élucider. 

Analyse de l'ADN

La réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est une technique moléculaire qui peut être utilisée pour détecter la présence d'ADN cible. Elle est très précise et la détection peut être identifiée dans de très petites quantités. Nous utilisons désormais cette technique pour identifier la présence d'agents pathogènes des plantes et de l'herbe. Ces agents pathogènes peuvent être fongiques ou non fongiques (par exemple, bactériens). Le modèle d'ADN cible (connu sous le nom d'amorce ou de tampon) est nécessaire pour l'amplification de l'ADN. Cette méthode utilise plusieurs amorces d'ADN dans la PCR. Il s'agit de la PCR multiplex.

Les agents pathogènes à ADN testés sont les suivants Bipolaris spp, Clarireedia spp, Colletotrichum spp., Drechslera spp., Fusarium poae , Gaeumannomyces spp, Laetisaria fuciformis , Microdochium nivale , Pyricularia grisea , Pythium spp, Rhizoctonia cerealis , R. solani , Sclerophthora macrospora. , Xanthomonas translucens , Labyrinthes spp. 

Ou communément appelé : Tache foliaire (Bipolaris & Dreschlera spp), dollar spot, antracnosis, Fusarium, take-all patch, red thread (hilo rojo), Microdochium patch, grey leaf spot, Pythium (damping off), yellow patch, brown patch, yellow tuft (mildiu velloso), bacterial wilt (marchitez bacteriana), Rapid blight(saloperie rapide). 

Six plants d'ivraie vivace ont été échantillonnés et préparés pour une analyse médico-légale plus poussée par réaction en chaîne de la polymérase (PCR).

Les feuilles, les pousses et les racines de l'ivraie vivace ont été coupées et homogénéisées pour l'analyse.

L'étape initiale de l'extraction de l'ADN a consisté à décomposer les cellules des feuilles, des pousses et des racines.

La planta extraída y el concentrado de ADN pathogène.

L'ADN extrait a été lavé et élué en vue de l'amplification de l'ADN par PCR.

Microtubes contenant la solution de réaction PCR pour les 15 pathogènes avec contrôle d'amplification.

Quatre pathogènes ont été positivement détectés par PCR quantitative en temps réel : Microdochium nivale (plaque de Fusarium), Pythium spp. (fonte des semis), Rhizoctonia solani (plaque brune) et R. cerealis (plaque jaune). Un niveau élevé de R. cerealis a été détecté.

Résultats de la PCR

Étant donné que l'ADN analysé ici ne comprenait pas de Cyanobactéries il n'a pas été possible de confirmer leur présence. Cependant, cette technique PCR multiplex a permis d'exclure 11 autres pathogènes du gazon échantillonné. Bien qu'il n'y ait pas eu de symptômes évidents de maladie pouvant être associés au Microdochium/Fusarium Patch ( Microdochium nivale ) o Pythium des hyphes caractéristiques de la plaque jaune ( Rhizoctonia cerealis ) ou la tache brune ( R. solani ) au moment de l'échantillonnage. L'analyse de l'ADN a permis de prouver sa présence. Il est intéressant de noter que la maladie des taches jaunes a été suspectée d'être la cause des taches au cours de l'été et de l'automne précédents (juillet-octobre) de 2021 et 2023. On sait que rhizoctone passe l'hiver dans l'herbe ou les débris végétaux. Comme le ray-grass échantillonné comprenait des feuilles, des racines, des pousses et du matériel foliaire décomposé, il est probable que des champignons hivernants aient été inclus dans la réaction.

Symptômes typiques de l'infection par la tache jaune survenant au cours des mois d'été 2022 et 2023 (cette photo date d'août 2023) sur le site.

Recommandations

Il est important de noter que de multiples pathogènes ont été identifiés dans ces échantillons. Normalement, nous nommons et discutons d'une maladie lorsque nous observons des signes et des symptômes dans le gazon. Dans le cas présent, au moins quatre ou cinq agents pathogènes sont impliqués. Les agents pathogènes identifiés peuvent avoir provoqué un jaunissement et un dépérissement avec une infection bactérienne secondaire. Il est possible que cette situation soit typique et que l'interaction entre ces agents pathogènes et d'autres troubles tels que les algues ait un effet combiné sur l'état du gazon, ce qui nécessite probablement un examen plus approfondi.

Les recommandations visant à contrôler ces menaces pour la santé et l'état des pelouses comprendraient un examen des approches biologiques et physiques. Par exemple, on sait que certaines espèces de bactéries Bacillus contrôle Rhizoctone . Il existe une gamme de produits disponibles sur le marché du gazon. Une intervention précoce à ce moment-là peut être plus efficace, comme c'est généralement le cas pour les contrôles biologiques. En cas d'infection par les cyanobactéries une application séquentielle de lumière UV-C est effectuée, en partant du principe que les algues sont sensibles aux rayons UV. L'application et le dosage de l'azote et du phosphore peuvent également être revus afin de garantir des niveaux suffisants. 

Le diagnostic des maladies du gazon est une étape importante dans la gestion efficace et efficiente du gazon. Qu'il s'agisse d'allouer des ressources et un budget, ou d'agir efficacement pour protéger l'environnement tout en maintenant des surfaces de jeu de qualité. Nous savons que la gestion préventive des maladies est souvent rentable et permet d'obtenir des surfaces de jeu de bonne qualité. 

Bien que la microscopie ait permis une large investigation de l'infection, elle n'a pas pu identifier l'agent pathogène exact. L'inspection microscopique a permis d'étudier les sites d'infection et d'observer les caractéristiques du champignon pathogène, comme le montrent les feuilles coupées endommagées par la faucheuse et le début de l'infection. Il s'agit là d'une première étape importante dans la recherche de la cause probable, au cas où une identification précise s'avérerait nécessaire. 

La technique PCR a permis de détecter avec précision les agents pathogènes présents, qu'ils soient symptomatiques ou qu'ils infectent le gazon de manière latente. Elle peut avoir fourni un indicateur presque prédictif d'une éventuelle maladie future. Cela signifie qu'un plan de traitement intégré pour ces pathogènes spécifiques peut être mis en place et suivi en permanence. 

L'identification précise des agents pathogènes en phase symptomatique ou dormante est mieux diagnostiquée en utilisant la microscopie et l'analyse moléculaire, comme le montre cette étude de cas. Ces techniques sont susceptibles de fournir au greenkeeper les meilleures informations pour une action immédiate et la planification de la gestion des maladies. En fait, elles semblent être les meilleures premières étapes vers une gestion intégrée proactive et préventive des maladies. 

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