Kit de Fitodiagnosis PCR. Diagnóstico de enfermedades del césped mediante microscopía y reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Este artículo ofrece una visión de la metodología de diagnóstico de enfermedades del césped, en el que se analiza la eficacia del Kit de Fitodiagnosis PCR de Tiloom. En el estudio se analizó raigrás perenne infectado de un campo deportivo del Leicester Football Club mediante microscopía y una técnica molecular. El proceso se inició con inspecciones visuales en campo y microscopía, el análisis concluyó mediante PCR cuantitativa en tiempo real. A resultado del cual se descartaron 11 patógenos comunes de la estación fría, con cuatro identificaciones positivas en varios niveles de infección, desde positivo débil hasta fuerte. Los hallazgos de estos métodos se analizan a continuación.

Fondo de la superficie del césped deportivo. 

El césped 100 % raigrás perenne que se estaba investigando se cortó varias veces por semana a 25 mm (reales). La semana anterior se aplicó alrededor de 50 kg N/ha, 15 Kg P/ha, 45 kg K/ha con un aminoácido y algas. Este campo fue sometido a unas 6 horas de entrenamiento de fútbol por semana.

Análisis de microscopio

Un sitio para la infección. Lesión del cortacésped en raigrás perenne desde el envés de la hoja.

Infección y muerte regresiva de la hoja cortada de raigrás perenne bajo el microscopio de disección. Las lesiones causadas por cortacésped parecen ser un lugar de muerte regresiva e infección. El ennegrecimiento y el color amarillento indicaron signos de material foliar infectado.

Se observaron hojas amarillentas y retorcidas en varias de las hojas de raigrás perenne inspeccionadas. Más evidente fue la muerte de las hojas desde la punta con estructuras de color gris blanquecino en las hojas moribundas, marchitas y retorcidas del raigrás perenne.

Bajo un microscopio óptico, se observaron más de cerca las estructuras filamentosas.

Se observó una infección bacteriana filamentosa teñida con 40x para mayor visibilidad dentro de las hojas de raigrás perenne.

Filamentos bacterianos teñidos a 25x con azul de anilina para visualización dentro de la hoja de raigrás perenne. Las bacterias filamentosas no se ramificaban y corrían longitudinalmente a lo largo de la hoja. 

Bacterias filamentosas a 40x teñidas con azul de anilina dentro de una hoja de raigrás perenne. Las bacterias agregadas no se ramifican y no tienen tabiques aparentes (secciones/paredes divisorias).

En una planta diferente dentro del área muestreada, bajo un microscopio de disección, se ve micelio algodonoso visible que sobresale del material de las hojas moribundas del raigrás perenne.

Hifas ramificadas, teñidas de azul bajo microscopio óptico 25x

Hifas ramificadas teñidas de azul dentro del raigrás perenne; desafortunadamente, se observó una ramificación en forma de T ligeramente desenfocada.

Resultados de microscopía

El trabajo de microscopía óptica identificó una infección bacteriana filamentosa potencialmente común, por ejemplo, posiblemente signos tempranos de una cianobacteria (infección por algas). En una planta diferente de la misma muestra, se observó más de cerca el micelio que sobresalía con ramificaciones observables en forma de T. Característica de Rhizoctonia spp. Sólo con más análisis moleculares se podría dilucidar esto. 

Análisis de ADN

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica molecular que se puede utilizar para detectar la presencia de ADN objetivo. Es muy preciso y la detección se puede identificar en cantidades muy pequeñas. Ahora utilizamos esta técnica para identificar la presencia de patógenos de plantas/césped. Estos patógenos pueden ser fúngicos o no fúngicos (por ejemplo, bacterianos). La plantilla del ADN objetivo (conocida como cebador o buffer) es necesaria para la amplificación del ADN. Este método utiliza múltiples cebadores de ADN en la PCR. Esto se conoce como PCR múltiple.

Los patógenos de ADN analizados incluyeron: Bipolaris spp., Clarireedia spp., Colletotrichum spp., Drechslera spp., Fusarium poae , Gaeumannomyces spp., Laetisaria fuciformis , Microdochium nivale , Pyricularia grisea , Pythium spp., Rhizoctonia cerealis , R. solani , Sclerophthora macrospora. , Xanthomonas translucens , Labyrinthula spp. 

O comúnmente conocido como: Leaf spot (Bipolaris & Dreschlera spp), dollar spot, antracnosis, Fusarium, take-all patch, red thread (hilo rojo), Microdochium patch, grey leaf spot, Pythium (damping off), yellow patch, brown patch, yellow tuft (mildiu velloso), bacterial wilt (marchitez bacteriana), Rapid blight(tizón rápido). 

Se tomaron muestras de seis plantas de raigrás perenne y se prepararon para análisis forenses adicionales mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

El material de hojas, brotes y raíces del raigrás perenne se cortó y homogeneizó para su análisis.

El paso inicial de la extracción de ADN fue la descomposición de las células del material de hojas, brotes y raíces.

La planta extraída y el concentrado de ADN patógeno.

El ADN extraído se lavó y eluyó en preparación para la amplificación del ADN mediante PCR

Microtubos que contienen solución de reacción de PCR para los 15 patógenos con control de amplificación.

Se detectaron positivamente cuatro patógenos mediante PCR cuantitativa en tiempo real: Microdochium nivale (Fusarium patch), Pythium spp. (damping off), Rhizoctonia solani (brown patch) y R. cerealis (Yellow Patch). Se detectó un nivel elevado de R. cerealis.

Resultados de la PCR

Como el ADN analizado aquí no incluía Cyanobacteria spp. no fue posible confirmar su presencia. Sin embargo, esta técnica de PCR múltiple descartó otros 11 patógenos del césped muestreado. Aunque no hubo síntomas obvios de enfermedad que pudieran estar asociados con Microdochium/Fusarium Patch ( Microdochium nivale ) o Pythium , se observaron mediante microscopía hifas características de Yellow Patch ( Rhizoctonia cerealis ) o Brown Patch ( R. solani ) en el momento del muestreo. El análisis de ADN proporcionó evidencia de su presencia. Curiosamente, se sospechaba que la enfermedad de Yellow Patch era la causa de las manchas en el verano y el otoño anteriores (julio-octubre) de 2021 y 2023. Se sabe que la rizoctonia pasa el invierno dentro del césped o los restos de plantas. Como el raigrás muestreado incluía hojas, raíces, brotes y material descompuesto de las hojas, es probable que en la reacción se incluyeran hongos que pasaron el invierno.

Síntomas típicos de infección por la mancha amarilla que ocurren en los meses de verano de 2022 y 2023 (esta foto es de agosto de 2023) en el sitio.

Recomendaciones

Es importante señalar que se identificaron múltiples patógenos en estas muestras. Normalmente, nombramos y discutimos una enfermedad cuando observamos signos y síntomas en el césped. En este caso intervienen al menos cuatro o cinco agentes patógenos. Los patógenos identificados pueden haber causado el amarillamiento y la muerte regresiva con una infección bacteriana secundaria. Posiblemente, esto sea típico, y la interacción entre estos patógenos y otros trastornos como las algas está teniendo un efecto combinado en la condición del césped; esto probablemente requiera más investigación.

Las recomendaciones para controlar estas amenazas a la salud y condición del césped incluirían la revisión de enfoques biológicos y físicos. Por ejemplo, se sabe que ciertas especies de bacterias Bacillus controlan Rhizoctonia . Hay una gama de productos disponibles en el mercado del césped. La intervención temprana en este momento puede tener una mayor eficacia, como es habitual en los controles biológicos. Para la infección por cianobacterias se realiza una aplicación secuencial de luz UV-C, bajo la premisa de que las algas son sensibles a los rayos UV. También podrán revisarse la aplicación y la dosis de nitrógeno y fósforo, con el fin de garantizar niveles suficientes. 

El diagnóstico de enfermedades del césped es un paso importante en el manejo eficiente y eficaz del césped. Ya sea asignando recursos y presupuesto, o actuando de manera eficiente y efectiva para proteger el medio ambiente y al mismo tiempo mantener superficies de juego de calidad. Sabemos que el manejo preventivo de enfermedades suele ser rentable y facilita superficies de juego de buena calidad. 

Si bien la microscopía permitió una investigación amplia de la infección, no pudo identificar el agente patógeno exacto. La inspección microscópica fue una oportunidad para investigar los sitios de infección y observar cualquier característica del hongo patógeno, como se muestra con las hojas cortadas dañadas por la cortadora de césped y el inicio de la infección. Este fue un paso inicial importante hacia la investigación de una causa probable, en caso de que se requiera una identificación precisa. 

La técnica de PCR fue precisa en la detección de patógenos presentes, ya sea que estos patógenos estuvieran infectando el césped de manera sintomática o latente. Es posible que haya proporcionado un indicador casi predictivo de posibles enfermedades futuras. Esto significa que se puede iniciar y monitorear continuamente un plan integrado de tratamientos para estos patógenos específicos. 

La mejor forma de diagnosticar la identificación precisa de patógenos en la fase sintomática o inactiva es utilizando microscopía y análisis molecular, como se muestra en este estudio de caso. Es probable que estas técnicas brinden al greenkeeper la mejor información para tomar medidas inmediatas y planificar el manejo de enfermedades. En esencia, estos parecen ser los mejores primeros pasos para una gestión integrada de enfermedades proactiva y preventiva. 

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