Kit di fitodiagnosi PCR. Diagnosi delle malattie dei tappeti erbosi mediante microscopia e reazione a catena della polimerasi (PCR).

Questo articolo fornisce una panoramica sulla metodologia di diagnosi delle malattie dei tappeti erbosi, analizzando l'efficacia della Kit PCR per la fitodiagnosi di Tiloom. Lo studio ha analizzato il loietto perenne infetto proveniente da un campo sportivo del Leicester Football Club mediante microscopia e tecnica molecolare. Il processo è iniziato con ispezioni visive sul campo e con la microscopia; l'analisi si è conclusa con la PCR quantitativa in tempo reale. Di conseguenza, sono stati esclusi 11 patogeni comuni della stagione fredda, con quattro identificazioni positive a vari livelli di infezione, da debolmente positivo a fortemente positivo. I risultati di questi metodi sono discussi di seguito.

Fondo della superficie erbosa sportiva. 

Il tappeto erboso di loglio perenne 100 % oggetto dell'indagine è stato falciato più volte alla settimana a 25 mm (effettivi). La settimana precedente sono stati applicati circa 50 kg di N/ha, 15 kg di P/ha, 45 kg di K/ha con un aminoacido e alghe. Questo campo è stato sottoposto a circa 6 ore di allenamento di calcio a settimana.

Analisi al microscopio

Un sito di infezione. Lesione da falciatura su loietto perenne dalla parte inferiore della foglia.

Infezione e deperimento del loietto sempreverde a foglie tagliate al microscopio sezionatore. Le lesioni causate dalla falciatura sembrano essere un sito di deperimento e infezione. L'annerimento e l'ingiallimento sono segni di materiale fogliare infetto.

Su molte delle foglie di loietto sempreverde ispezionate sono stati osservati ingiallimenti e torsioni. Più evidente è stato il distacco delle foglie dalla punta con strutture grigio-biancastre sulle foglie morenti, appassite e contorte del loglio perenne.

Al microscopio ottico, le strutture filamentose sono state osservate più da vicino.

All'interno delle foglie di loglio perenne è stata osservata un'infezione batterica filamentosa colorata a 40x per renderla visibile.

Filamenti batterici colorato a 25x con blu di anilina per la visualizzazione all'interno della foglia di loglio sempreverde. Il batteri filamentosi non si è distaccata e non ha corso longitudinalmente lungo la lunghezza del foglio. 

Batteri filamentosi a 40x colorati con blu di anilina all'interno di una foglia di loglio perenne. I batteri aggregati non sono ramificati e non presentano partizioni apparenti (sezioni divisorie/muri).

Su un'altra pianta all'interno dell'area campionata, al microscopio da dissezione, è visibile un micelio cotonoso che sporge dal materiale fogliare morente del loglio perenne.

Ife ramificate, colorate di blu al microscopio ottico 25x.

Ife ramificate colorate di blu all'interno del loglio perenne; purtroppo è stata osservata una ramificazione a forma di T leggermente non focalizzata.

Risultati della microscopia

Il lavoro di microscopia ottica ha identificato un'infezione batterica filamentosa potenzialmente comune, per esempio, forse i primi segni di un'infezione di tipo "atipico". cianobatteri (infezione algale). Su un'altra pianta dello stesso campione, il micelio sporgente è stato osservato più da vicino con ramificazioni osservabili a forma di T. Caratteristica di Rizoctonia spp. Solo con ulteriori analisi molecolari è stato possibile chiarire questo aspetto. 

Analisi del DNA

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica molecolare che può essere utilizzata per rilevare la presenza di DNA bersaglio. È molto accurata e la rilevazione può essere effettuata in quantità molto piccole. Oggi utilizziamo questa tecnica per identificare la presenza di patogeni di piante/erba. Questi agenti patogeni possono essere fungini o non fungini (ad esempio, batterici). Per l'amplificazione del DNA è necessario un modello di DNA bersaglio (noto come primer o tampone). Questo metodo utilizza più primer di DNA nella PCR. Questo metodo è noto come PCR multipla.

I patogeni del DNA analizzati comprendono: Bipolaris spp, Clarireedia spp, Colletotrichum spp., Drechslera spp., Fusarium poae , Gaeumannomyces spp, Laetisaria fuciformis , Microdochium nivale , Pyricularia grisea , Pythium spp, Rhizoctonia cerealis , R. solani , Sclerophthora macrospora. , Xanthomonas translucens , Labirintola spp. 

O comunemente conosciuta come: Macchia fogliare (Bipolaris & Dreschlera spp), dollar spot, antracnosi, Fusarium, take-all patch, red thread, Microdochium patch, grey leaf spot, Pythium (damping off), yellow patch, brown patch, yellow tuft (peronospora), bacterial wilt, Rapid blight(smut rapido). 

Sei piante di loietto perenne sono state campionate e preparate per ulteriori analisi forensi mediante reazione a catena della polimerasi (PCR).

Il materiale di foglie, germogli e radici di loglio perenne è stato tagliato e omogeneizzato per l'analisi.

La fase iniziale dell'estrazione del DNA è stata la decomposizione delle cellule di foglie, germogli e radici.

Il concentrato di DNA vegetale e patogeno estratto.

Il DNA estratto è stato lavato ed eluito in preparazione all'amplificazione del DNA mediante PCR.

Microprovette contenenti la soluzione di reazione PCR per i 15 patogeni con controllo di amplificazione.

Quattro patogeni sono stati rilevati positivamente mediante PCR quantitativa in tempo reale: Microdochium nivale (Fusarium patch), Pythium spp. (damping off), Rhizoctonia solani (brown patch) e R. cerealis (Yellow Patch). È stato rilevato un alto livello di R. cerealis.

Risultati della PCR

Poiché il DNA analizzato non comprendeva Cianobatteri spp. non è stato possibile confermarne la presenza. Tuttavia, questa tecnica di PCR multipla ha escluso 11 altri agenti patogeni dal tappeto erboso campionato. Sebbene non vi fossero sintomi evidenti di malattia che potessero essere associati a Microdochium/Fusarium Patch ( Microdochium nivale ) o Pythium ife caratteristiche della macchia gialla ( Rhizoctonia cerealis ) o Brown Patch ( R. solani ) al momento del campionamento. L'analisi del DNA ha fornito la prova della sua presenza. È interessante notare che la malattia delle macchie gialle è stata sospettata di essere la causa delle macchie nell'estate e nell'autunno precedenti (luglio-ottobre) del 2021 e del 2023. È noto che rizoctonia sverna all'interno dell'erba o dei detriti vegetali. Poiché il loglio campionato comprendeva foglie, radici, germogli e materiale fogliare decomposto, è probabile che i funghi svernanti siano stati inclusi nella reazione.

Sintomi tipici dell'infezione da macchia gialla che si verificano nei mesi estivi del 2022 e del 2023 (questa foto è dell'agosto 2023) presso il sito.

Raccomandazioni

È importante notare che in questi campioni sono stati identificati più agenti patogeni. Normalmente, diamo un nome a una malattia e ne parliamo quando osserviamo segni e sintomi nel tappeto erboso. In questo caso sono coinvolti almeno quattro o cinque agenti patogeni. Gli agenti patogeni identificati potrebbero aver causato ingiallimento e deperimento con infezione batterica secondaria. È possibile che si tratti di una situazione tipica e che l'interazione tra questi agenti patogeni e altri disturbi, come le alghe, abbia un effetto combinato sulle condizioni del tappeto erboso; questo probabilmente richiede ulteriori indagini.

Le raccomandazioni per controllare queste minacce alla salute e alle condizioni dei tappeti erbosi dovrebbero includere una revisione degli approcci biologici e fisici. Ad esempio, è noto che alcune specie di batteri Bacillo controllo Rizoctonia . Esiste una gamma di prodotti disponibili sul mercato dei tappeti erbosi. Un intervento precoce in questo momento può avere una maggiore efficacia, come avviene di solito con i controlli biologici. Per le infezioni dai cianobatteri si effettua un'applicazione sequenziale di luce UV-C, partendo dal presupposto che le alghe sono sensibili ai raggi UV. Anche l'applicazione e il dosaggio di azoto e fosforo possono essere rivisti per garantire livelli sufficienti. 

La diagnosi delle malattie del tappeto erboso è un passo importante per una gestione efficiente ed efficace dello stesso. Sia che si tratti di allocare risorse e budget, sia che si tratti di agire in modo efficiente ed efficace per proteggere l'ambiente e mantenere superfici di gioco di qualità. Sappiamo che la gestione preventiva delle malattie è spesso efficace dal punto di vista dei costi e garantisce una buona qualità delle superfici di gioco. 

Sebbene la microscopia abbia consentito un'ampia indagine dell'infezione, non è stata in grado di identificare l'esatto agente patogeno. L'ispezione al microscopio è stata un'opportunità per indagare i siti di infezione e osservare eventuali caratteristiche del fungo patogeno, come dimostrato dalle foglie tagliate con la falciatrice e dall'inizio dell'infezione. Si è trattato di un importante passo iniziale per indagare sulla probabile causa, qualora fosse necessaria un'identificazione precisa. 

La tecnica della PCR è stata accurata nel rilevare gli agenti patogeni presenti, sia che questi fossero sintomatici sia che infettassero in modo latente il tappeto erboso. Può aver fornito un indicatore quasi predittivo di possibili malattie future. Ciò significa che è possibile avviare un piano di trattamento integrato per questi patogeni specifici e monitorarli costantemente. 

L'identificazione accurata dei patogeni nella fase sintomatica o quiescente è meglio diagnosticata utilizzando la microscopia e l'analisi molecolare, come mostrato in questo caso di studio. Queste tecniche sono in grado di fornire al greenkeeper le migliori informazioni per un'azione immediata e per la pianificazione della gestione della malattia. In sostanza, questi sembrano essere i primi passi migliori per una gestione integrata proattiva e preventiva delle malattie. 

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