PhytAlert Turf e la tecnica qPCR: la chiave per le malattie dei tappeti erbosi

Per decenni, la tecnica qPCR è stata una tecnica ampiamente utilizzata e indispensabile per i laboratori medici e biologici. Oggi è conosciuta in tutto il mondo come la tecnica di rilevamento del COVID-19 ed è la chiave per un tappeto erboso sano. kit PhytAlert Turf da Microgaia Biotech.

Grazie alla qPCR si aprono nuovi modi per studiare la salute dei nostri tappeti erbosi.

Nuovi modi di studiare la salute dei tappeti erbosi si stanno aprendo in tutto il mondo grazie alla tecnologia messa in pratica con il nostro nuovo kit Phytfieldlab.

Questa tecnica si basa sull'amplificazione esponenziale di molecole di DNA, utilizzando l'enzima DNA polimerasi termostabile. Il suo acronimo è PCR: Polymerase Chain Reaction. Si tratta di una tecnica ormai accessibile, che consente di effettuare diagnosi rapide e precise in tutti i campi.

Ora possiamo applicare questa tecnica per conoscere lo stato fitosanitario delle nostre superfici sportive, cioè possiamo identificare i microrganismi patogeni, sia nella pianta che nel terreno, prima che producano la malattia. Questo permette al greenkeeper di prendere decisioni sul tipo di trattamento da utilizzare, valutando la reale necessità della sua applicazione, risparmiando sui costi, ottimizzando i trattamenti e riducendo la presenza di questi composti chimici nel terreno.

Con il KIT PhytAlert Turf è possibile diagnosticare l'erba in modo rapido e preciso.

I principali vantaggi sono:

• Controllo e monitoraggio: permette di anticipare la comparsa dei primi sintomi fitopatogeni.
• Prevenzione: analisi delle condizioni del suolo prima dell'impianto di un tappeto erboso o di una qualsiasi coltura.
• Certificazione di manto erboso esente da patogeni prima dell'installazione nei nostri stadi o green.
• Diagnosi delle malattie nei prati sintomatici e asintomatici: trattamenti mirati ed efficaci, evitando l'uso di prodotti ad ampio spettro.
• Rilevamento ad ampio raggio (substrato, pianta, acqua, semi).
• Rilevamento e quantificazione dei microrganismi prima e dopo il trattamento con prodotti fitosanitari per verificarne l'efficacia.
• Controllo di qualità dei prodotti formulati con microrganismi benefici.

Differenze tra una PCR e una qPCR

Nella tecnica convenzionale della PCR, se si vuole verificare se il DNA si è amplificato, e quindi se il microrganismo di interesse è presente o meno nel campione, è necessario eseguire un'altra tecnica aggiuntiva chiamata elettroforesi. Tuttavia, anche quando si esegue l'elettroforesi e si controlla che il DNA si sia amplificato, non è possibile quantificare il DNA amplificato, cioè non si può sapere se la quantità del microrganismo che si vuole analizzare è alta o bassa.

Esiste una versione della tecnica PCR, chiamata PCR in tempo reale o qPCR, che permette, oltre a rilevare l'esistenza di questi microrganismi in anticipo, di quantificarli in tempo reale, immediatamente. La tecnica qPCR presenta quindi un chiaro vantaggio rispetto alla PCR convenzionale, in quanto ci permette di verificare il reale livello di infezione da parte di microrganismi patogeni e se la loro presenza nel prato è rilevante o meno.

OPERAZIONE qPCR

La qPCR è una tecnica che consente la duplicazione del DNA a partire da una piccola quantità di questa molecola, nota come DNA modello. Ciò è reso possibile da un enzima, la DNA polimerasi. Questa tecnica permette di monitorare l'amplificazione del DNA grazie al segnale prodotto da un marcatore fluorescente attaccato a uno dei componenti della reazione, che fornirà un segnale luminoso di intensità proporzionale alla quantità di DNA prodotto. Pertanto, maggiore è la quantità di DNA, maggiore sarà la luce emessa dal marcatore fluorescente.

Il segnale emesso viene intercettato da un software che raccoglie le letture in una curva che rappresenta l'intero ciclo di reazione di amplificazione.

Questa apparecchiatura si chiama termociclatore e, come indica il nome, ha il compito di effettuare i cicli di temperatura necessari per la reazione di amplificazione del DNA. I cicli di temperatura impostati vengono ripetuti circa 40 volte e in ognuno di essi si svolgono le seguenti fasi:

• Prima parte del ciclo, temperatura 95º. La molecola di DNA templato viene denaturata.
• Seconda parte del ciclo, temperatura 60º. Legame dei primer alla molecola di DNA modello.
• Terza parte del ciclo, temperatura 72º. La DNA polimerasi allunga il filamento di DNA dai primer che sono stati attaccati al filamento nella fase precedente, elidendo i dNTP.

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In ogni ciclo di temperatura eseguito dal termociclatore, viene prodotta una copia di ciascuno dei filamenti di DNA, per cui se si parte da una nuova molecola di DNA, si otterranno 2 filamenti di DNA nel 1° ciclo, 4 filamenti di DNA nel 2° ciclo, 8 filamenti di DNA nel 3° ciclo e così via fino all'ultimo ciclo, dove si saranno ottenuti milioni di filamenti di DNA.

Quando l'amplificazione del DNA avviene in una reazione qPCR, è possibile vedere in tempo reale come le molecole di DNA vengono duplicate. Questo perché uno dei componenti della reazione, la sonda, è marcato con un composto fluorescente che emette luce solo quando i filamenti di DNA vengono duplicati. Pertanto, più filamenti di DNA vengono duplicati, più luce emette il marcatore, che viene catturato dai sensori del termociclatore e infine interpretato dal software.

Nel momento in cui la luce generata dal composto fluorescente inizia a essere significativamente visibile (indicata da una curva nel software), significa che è stato creato un numero sufficiente di copie del DNA modello per poterlo rilevare. Questo momento è noto come soglia di rilevamento, il che significa che da quel ciclo in poi si verifica il rilevamento del DNA modello. Nel caso in cui il DNA modello provenga da un microrganismo, si può dire che si è verificato il rilevamento di tale microrganismo.

Come interpretare le informazioni fornite da una qPCR?

Le informazioni ottenute da una reazione qPCR variano a seconda del motivo della reazione.

Nel caso della rilevazione di microrganismi patogeni per le piante, l'informazione ricercata è la rilevazione di questi patogeni attraverso il DNA. È inoltre estremamente utile conoscere la quantità del microrganismo presente nel campione analizzato.

Nel caso in cui sia presente il DNA del microrganismo ricercato, durante la reazione qPCR si può vedere in tempo reale se avviene la duplicazione del DNA grazie al segnale emesso dal marcatore fluorescente. Una linea di amplificazione esponenziale appare in corrispondenza della soglia di rilevamento, che, come già detto, è il momento in cui si può affermare che il microrganismo è presente nel campione.

Se la rilevazione avviene in tempi brevi, cioè nei primi cicli, significa che abbiamo più microrganismi che se la rilevazione avviene in cicli tardivi. Ciò si basa sul fatto che se iniziamo con un numero maggiore di copie di DNA, e quindi con un numero maggiore di microrganismi, raggiungeremo prima le copie di DNA necessarie affinché i sensori del termociclatore possano rilevarle.

Tiloom insieme a Microgaia vuole tecnologizzare il settore dei tappeti erbosi sportivi e con il nostro KIT PhytAlert Turf è possibile fare un passo avanti nella salute delle piante.