PhytAlert Turf e técnica qPCR: chave para as doenças dos relvados

Durante décadas, a técnica qPCR tem sido uma técnica amplamente utilizada e indispensável para laboratórios médicos e biológicos. Hoje em dia, é popularmente conhecida em todo o mundo, a técnica de deteção da COVID-19 e é a chave para um relvado saudável, uma nova forma de estudar o relvado, que a Tiloom apresenta à indústria do relvado com o kit inovador PhytAlert Turf de Microgaia Biotech.

Graças à qPCR, estão a surgir novas formas de estudar a saúde dos nossos relvados.

Estão a surgir novas formas de estudar a saúde dos relvados em todo o mundo, graças à tecnologia posta em prática com o nosso novo kit Phytfieldlab.

Esta técnica baseia-se na amplificação exponencial de moléculas de ADN, utilizando a enzima ADN polimerase termoestável. O seu acrónimo é PCR: Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase). Atualmente, é uma técnica acessível para que todos os campos possam ser diagnosticados com rapidez e precisão.

Agora podemos aplicar esta técnica para conhecer o estado fitossanitário das nossas superfícies desportivas, ou seja, podemos identificar os microrganismos patogénicos, tanto na planta como no solo, antes de produzirem a doença. Isto permite ao responsável pelo relvado tomar decisões sobre o tipo de tratamento a utilizar, avaliando a necessidade real da sua aplicação, poupando custos, optimizando os tratamentos e reduzindo a presença destes compostos químicos no solo.

Com o KIT PhytAlert Turf pode diagnosticar a erva com rapidez e precisão.

As principais vantagens são:

• Controlo e monitorização: permite antecipar o aparecimento dos primeiros sintomas fitopatogénicos.
• Prevenção: análise do estado do solo antes da instalação da relva ou de qualquer cultura.
• Certificação de relva livre de agentes patogénicos antes da instalação nos nossos estádios ou greens.
• Diagnóstico de doenças em relvados sintomáticos e assintomáticos: tratamentos orientados e eficazes, evitando a utilização de produtos de largo espetro.
• Ampla gama de deteção (substrato, planta, água, sementes).
• Deteção e quantificação de microrganismos antes e depois do tratamento com produtos fitofarmacêuticos para verificar a sua eficácia.
• Controlo de qualidade de produtos formulados com microrganismos benéficos.

Diferenças entre uma PCR e uma qPCR

Na técnica de PCR convencional, se quisermos verificar se o ADN amplificou e, portanto, se o microrganismo de interesse está presente na amostra ou não, é necessário realizar outra técnica adicional chamada eletroforese. No entanto, mesmo realizando a eletroforese e verificando que o ADN amplificou, em nenhum momento é possível quantificar o ADN que amplificámos, ou seja, não podemos saber se temos uma quantidade alta ou baixa do microrganismo que queremos analisar.

Existe uma versão da técnica de PCR, denominada PCR em tempo real ou qPCR, que permite, para além da deteção precoce da existência destes microrganismos, a quantificação dos mesmos em tempo real, de forma imediata. Assim, a técnica de qPCR tem uma clara vantagem sobre a PCR convencional, pois permite-nos verificar o nível real de infeção por microrganismos patogénicos, e se a sua presença no relvado é relevante ou não.

funcionamento da qPCR

A qPCR é uma técnica que permite a duplicação do ADN a partir de uma pequena quantidade desta molécula, conhecida como ADN modelo. Isto é possível graças a uma enzima, a ADN polimerase. Esta técnica permite monitorizar a amplificação do ADN graças ao sinal produzido por um marcador fluorescente ligado a um dos componentes da reação, que fornecerá um sinal luminoso de intensidade proporcional à quantidade de ADN produzido. Assim, quanto mais ADN existir, mais luz emitirá o marcador fluorescente.

O sinal emitido é intercetado por um software que recolhe as leituras numa curva que representa todo o ciclo de reação de amplificação.

Este equipamento chama-se Termociclador e, como o seu nome indica, é responsável por realizar os ciclos de temperatura necessários para que a reação de amplificação do ADN tenha lugar. Os ciclos de temperatura definidos são repetidos cerca de 40 vezes e, em cada um deles, ocorrem os seguintes passos:

• 1ª parte do ciclo, temperatura 95º. A molécula de ADN modelo é desnaturada.
• 2ª parte do ciclo, temperatura 60º. Ligação dos primers à molécula de ADN modelo.
• 3ª parte do ciclo, temperatura 72º. A DNA polimerase alonga a cadeia de DNA a partir dos primers que foram ligados à cadeia na etapa anterior, eluindo dNTPs.

A mais alta tecnologia de diagnóstico disponível para a sua área.

Em cada ciclo de temperatura efectuado pelo termociclador, é produzida uma cópia de cada uma das cadeias de ADN, de modo que, se começarmos com uma nova molécula de ADN, obteremos 2 cadeias de ADN no 1.º ciclo, 4 cadeias de ADN no 2.º ciclo, 8 cadeias de ADN no 3.º ciclo e assim sucessivamente até ao último ciclo, onde teremos obtido milhões de cadeias de ADN.

Quando ocorre a amplificação do ADN numa reação de qPCR, é possível ver em tempo real como as moléculas de ADN estão a ser duplicadas. Isto deve-se ao facto de um dos componentes da reação, a sonda, estar marcado com um composto fluorescente, que emite luz apenas quando as cadeias de ADN são duplicadas. Assim, quanto mais cadeias de ADN forem duplicadas, mais luz o marcador emitirá, que será captada pelos sensores do termociclador e finalmente interpretada pelo software.

No momento em que a luz gerada pelo composto fluorescente começa a ser significativamente visível (indicada por uma curva no software), significa que foram feitas cópias suficientes do ADN modelo para que este possa ser detectado. Este momento é conhecido como o limiar de deteção, o que significa que, a partir desse ciclo, ocorreu a deteção do ADN modelo. No caso de o ADN modelo ser proveniente de um microrganismo, pode dizer-se que ocorreu a deteção desse microrganismo.

Como é que interpreto a informação fornecida por uma qPCR?

A informação obtida a partir de uma reação de qPCR varia em função da razão da reação.

No caso da deteção de microrganismos fitopatogénicos, a informação que se procura é a deteção destes agentes patogénicos através do ADN. É também extremamente útil saber qual a quantidade do microrganismo presente na amostra analisada.

No caso de o ADN do microrganismo procurado estar presente, durante a reação de qPCR, podemos ver em tempo real se a duplicação do ADN ocorre graças ao sinal emitido pelo marcador fluorescente. Uma linha de amplificação exponencial aparece no limiar de deteção, que, como já foi referido, é o momento em que se pode dizer que o microrganismo está presente na amostra.

Se a deteção ocorrer num curto espaço de tempo, ou seja, nos primeiros ciclos, significa que temos mais microrganismos do que se a deteção ocorrer nos últimos ciclos. Isto baseia-se no facto de que, se começarmos com um maior número de cópias de ADN e, por conseguinte, um maior número de microrganismos, atingiremos mais cedo as cópias de ADN necessárias para que os sensores do termociclador os detectem.

A Tiloom, juntamente com a Microgaia, quer tecnificar o sector dos relvados desportivos e, através do nosso KIT PhytAlert Turf pode dar um passo em frente na saúde das plantas.