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ANÁLISE DO SOLO E DOS MICRORGANISMOS

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Javier Méndez Lorente
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Índice: ANÁLISE DO SOLO E DOS MICRORGANISMOS

O crescente interesse pela microbiologia do solo deve-se à contribuição dos microrganismos para a produtividade e sustentabilidade agrícola. A conscientização de pesquisadores, produtores rurais e empresas de insumos biológicos sobre a importância da atividade biológica para a agricultura tem influenciado a criação e adaptação de técnicas e ferramentas que permitem a expansão do conhecimento.
nos microrganismos.

ETAPA 1. Extração de ADN e preparação de bibliotecas.

  1. A extração de ADN é efectuada com o kit DNeasy PowerLyzer PowerSoil DNeasy da Qiagen (Hilden, Alemanha).
  2. A BeCrop utiliza primers personalizados para a amplificação por PCR que visam especificamente a região 16S rRNA V4 e a região ITS1.
  3. Os amplicões são purificados utilizando o kit KAPA Pure Beads (Roche, Basileia, Suíça), enquanto a amplificação correcta de 16S e ITS é avaliada utilizando um gel de agarose.
  4. Os produtos de PCR purificados são então submetidos à preparação da biblioteca, seguindo um protocolo de PCR da Illumina em duas etapas.
  5. O ADN é então quantificado utilizando um fluorómetro Qubit com o kit de ensaio Qubit HS 500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA).
  6. Finalmente, as bibliotecas são sequenciadas num instrumento Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, CA, EUA) utilizando 2 × 251 leituras de extremidade emparelhada.

ETAPA 2. Processamento de bioinformática

  1. Os primers são removidos das leituras emparelhadas utilizando o Cutadapt.
  2. As leituras aparadas são depois fundidas com uma sobreposição mínima de 100 nucleótidos.
  3. As sequências são então filtradas por qualidade utilizando o erro esperado com um valor máximo de 1,0.
  4. Após o pré-processamento de qualidade, as leituras com diferenças de nucleótido único são iterativamente agrupadas para formar ASVs (variantes de sequenciação de amplicons) utilizando o Swarm.
  5. Subsequentemente, as quimeras de novo e os singletons restantes são removidos.
  6. Finalmente, a taxonomia é atribuída a partir de ASV utilizando um alinhamento global com uma identidade de 97% contra uma base de dados de referência com curadoria de SILVA 138.1 para sequências 16S e UNITE 8.3 para sequências ITS.

ETAPA 3. Cálculo dos índices do microbioma e das propriedades da rede.

As propriedades da rede local são determinadas de acordo com o procedimento descrito por Ortiz-Alvarez et al:

  1. As redes de comunidades microbianas para amostras 16S e ITS são construídas de forma independente, seguindo a metodologia descrita numa publicação anterior.
  2. A meta-rede de presença-ausência com todas as amostras é construída utilizando contagens rarefeitas e os pares ASV, que ocorrem com uma frequência significativamente superior ou inferior à esperada, são preservados e a rede de coocorrência ou de co-exclusão é determinada, respetivamente.
  3. As propriedades da rede local para ambos os marcadores são calculadas tanto para a coocorrência como para a co-exclusão: modularidade, transitividade e comprimento médio do caminho.
  • O modularidade descreve a separação entre grupos de microrganismos (módulos) que tendem a coexistir ou, muitas vezes, a excluir-se mutuamente em nichos ecológicos específicos.
  • O transitividade (coeficiente de agrupamento) mede a tendência dos nós ligados para formarem triângulos fechados.
  • O comprimento médio das estradas quantifica o grau de conetividade para ir de um lado da rede ao outro.

O Índices BeCrop são indicadores utilizados para avaliar o estado de saúde dos solos com base em dados metagenómicos, tal como descrito por Acedo et al. Estes indicadores avaliam características relevantes relacionadas com a saúde do solo que vão desde o potencial metabólico até ao biocontrolo e às estimativas hormonais.

As bases de dados subjacentes inferem o adaptação ao stress com base em vários mecanismos: ácido abscísico (ABA), 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) desaminase, produção de exopolissacáridos (EPS), solubilização de metais pesados, ácido salicílico, tolerância aos sais e produção de sideróforos.

Além disso, oferecem um produção potencial de hormonas com base na produção de citocininas, giberelina e IAA. Todas as abundâncias de mecanismos potenciais baseiam-se na combinação de abundâncias procarióticas e fúngicas relevantes e são escaladas para um índice de 1 a 6, em que 1 indica baixa abundância e 6 indica elevada abundância na respectiva amostra de solo.

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