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ANÁLISIS DE SUELO Y MICROORGANISMOS

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Javier Méndez Lorente
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Índice de contenidos: ANÁLISIS DE SUELO Y MICROORGANISMOS

El creciente interés en la microbiología del suelo se debe a la contribución de los microorganismos a la productividad y sostenibilidad agrícola. La concientización de investigadores, productores rurales y empresas de insumos biológicos sobre la importancia de la actividad biológica para la agricultura ha influido en la creación y adaptación de técnicas y herramientas que permiten ampliar el conocimiento
sobre los microorganismos.

ETAPA 1. Extracción de ADN y preparación de bibliotecas.

  1. La extracción de ADN se realiza con el kit DNeasy PowerLyzer PowerSoil de Qiagen (Hilden, Alemania).
  2. BeCrop utiliza cebadores personalizados para la amplificación por PCR dirigidos específicamente a la región 16S rRNA V4 y la región ITS1.
  3. Los amplicones se purifican utilizando el kit KAPA Pure Beads (Roche, Basilea, Suiza), mientras que la amplificación correcta de 16S e ITS se evalúa utilizando gel de agarosa.
  4. Los productos de PCR purificados se someten luego a la preparación de la biblioteca, siguiendo un protocolo de PCR Illumina de dos pasos.
  5. A continuación, se cuantifica el ADN utilizando un fluorómetro Qubit con el kit de ensayo Qubit HS 500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.).
  6. Finalmente, las bibliotecas se secuencian en un instrumento Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) utilizando 2 × 251 lecturas de extremos emparejados.

ETAPA 2. Procesamiento Bioinformático

  1. Los cebadores se eliminan de las lecturas de pares utilizando Cutadapt.
  2. Luego, las lecturas recortadas se fusionan con una superposición mínima de 100 nucleótidos.
  3. A continuación, las secuencias se filtran por calidad utilizando el error esperado con un valor máximo de 1,0.
  4. Después de un preprocesamiento de calidad, las lecturas con diferencias de un solo nucleótido se agrupan iterativamente para formar ASV (variantes de secuenciación de amplicones) utilizando Swarm.
  5. Posteriormente se eliminan las quimeras de novo y los singletons restantes.
  6. Finalmente, la taxonomía se asigna a partir de ASV utilizando una alineación global con una identidad del 97% frente a una base de datos de referencia curada de SILVA 138.1 para secuencias 16S y UNITE 8.3 para secuencias ITS.

ETAPA 3. Cálculo de índices de microbiomas y propiedades de red.

Las propiedades de la red local se determinan siguiendo el procedimiento descrito por Ortiz-Alvarez et al:

  1. Se construyen redes comunitarias microbianas para muestras 16S e ITS de forma independiente siguiendo la metodología informada en una publicación anterior.

  2. La meta-red de presencia-ausencia con todas las muestras se construye utilizando recuentos enrarecidos y los pares ASV, que ocurren con una frecuencia significativamente mayor o menor de lo esperado, se preservó y determinó la red de coocurrencia o coexclusión, respectivamente.

  3. Las propiedades de la red local para ambos marcadores se calculan tanto para la coocurrencia como para la coexclusión: modularidad, transitividad y longitud promedio de la ruta.
  • La modularidad describe la separación entre grupos de microorganismos (módulos) que tienden a coexistir o excluirse con frecuencia en nichos ecológicos específicos.
  • La transitividad (coeficiente de agrupamiento) mide la tendencia de los nodos conectados a formar triángulos cerrados.
  • La longitud media del camino cuantifica el grado de conectividad para ir de un lado de la red a otro.

Los índices BeCrop son indicadores utilizados para evaluar el estado de salud de los suelos basándose en datos metagenómicos como lo describen Acedo et al. Estos indicadores evalúan rasgos relevantes relacionados con la salud del suelo que van desde el potencial metabólico hasta el biocontrol y las estimaciones hormonales.

Las bases de datos subyacentes infieren la adaptación al estrés basándose en varios mecanismos: ácido abscísico (ABA), 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) desaminasa, producción de exopolisacáridos (EPS), solubilización de metales pesados, ácido salicílico, tolerancia a la sal y producción de sideróforos.

Además, ofrecen una producción potencial de hormonas basada en la producción de citoquininas, giberelina y IAA. Todas las abundancias de mecanismos potenciales se basan en la combinación de abundancias de procarióticos y hongos relevantes y se escalan a un índice de 1 a 6, donde 1 indica baja abundancia y 6 indica alta abundancia en la muestra de suelo respectiva.

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