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ANALYSE VON BODEN UND MIKROORGANISMEN

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Javier Méndez Lorente
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Das Inhaltsverzeichnis: ANALYSE VON BODEN UND MIKROORGANISMEN

Das wachsende Interesse an der Bodenmikrobiologie ist auf den Beitrag der Mikroorganismen zur landwirtschaftlichen Produktivität und Nachhaltigkeit zurückzuführen. Das Bewusstsein von Forschern, ländlichen Erzeugern und Unternehmen für biologische Inputs über die Bedeutung biologischer Aktivitäten für die Landwirtschaft hat die Entwicklung und Anpassung von Techniken und Instrumenten beeinflusst, die eine Erweiterung des Wissens ermöglichen.
auf Mikroorganismen.

STUFE 1. DNA-Extraktion und Vorbereitung der Bibliothek.

  1. Die DNA-Extraktion erfolgt mit dem DNeasy PowerLyzer PowerSoil DNeasy Kit von Qiagen (Hilden, Deutschland).
  2. BeCrop verwendet kundenspezifische Primer für die PCR-Amplifikation, die speziell auf die 16S rRNA V4-Region und die ITS1-Region ausgerichtet sind.
  3. Die Amplikons werden mit dem KAPA Pure Beads Kit (Roche, Basel, Schweiz) gereinigt, während die korrekte Amplifikation von 16S und ITS mit Hilfe eines Agarosegels überprüft wird.
  4. Die gereinigten PCR-Produkte werden dann einer Bibliotheksvorbereitung unterzogen, die einem zweistufigen Illumina PCR-Protokoll folgt.
  5. Die DNA wird dann mit einem Qubit-Fluorometer und dem Qubit HS 500 Assay-Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) quantifiziert.
  6. Schließlich werden die Bibliotheken auf einem Illumina MiSeq-Gerät (Illumina, San Diego, CA, USA) mit 2 × 251 Paired-End-Reads sequenziert.

STUFE 2. Bioinformatik-Verarbeitung

  1. Die Primer werden mit Cutadapt aus den gepaarten Reads entfernt.
  2. Die getrimmten Reads werden dann mit einer Mindestüberlappung von 100 Nukleotiden zusammengeführt.
  3. Die Sequenzen werden dann anhand des erwarteten Fehlers mit einem Maximalwert von 1,0 auf Qualität gefiltert.
  4. Nach der Qualitätsvorverarbeitung werden Reads mit Einzelnukleotidunterschieden iterativ gepoolt, um ASVs (Amplikonsequenzierungsvarianten) mit Swarm zu bilden.
  5. Anschließend werden de novo-Chimären und verbleibende Singletons entfernt.
  6. Schließlich wird die Taxonomie von ASV anhand eines globalen Alignments mit einer Identität von 97% gegen eine kuratierte Referenzdatenbank von SILVA 138.1 für 16S-Sequenzen und UNITE 8.3 für ITS-Sequenzen zugeordnet.

STUFE 3. Berechnung von Mikrobiom-Indizes und Netzwerkeigenschaften.

Die Eigenschaften des lokalen Netzes werden nach dem von Ortiz-Alvarez et al. beschriebenen Verfahren bestimmt:

  1. Mikrobielle Gemeinschaftsnetze für 16S- und ITS-Proben werden unabhängig voneinander nach der in einer früheren Veröffentlichung beschriebenen Methodik erstellt.
  2. Das Präsenz-Absenz-Metanetzwerk mit allen Proben wird unter Verwendung von Rarefied Counts konstruiert. ASV-Paare, die mit einer signifikant höheren oder niedrigeren Häufigkeit als erwartet auftreten, bleiben erhalten und das Co-Occurrence- bzw. Co-Exclusion-Netzwerk wird bestimmt.
  3. Lokale Netzwerkeigenschaften für beide Marker werden sowohl für das gemeinsame Auftreten als auch für den gemeinsamen Ausschluss berechnet: Modularität, Transitivität und durchschnittliche Pfadlänge.
  • Die Modularität beschreibt die Trennung zwischen Gruppen von Mikroorganismen (Modulen), die in bestimmten ökologischen Nischen nebeneinander existieren oder sich oft gegenseitig ausschließen.
  • Die Transitivität (Clustering-Koeffizient) misst die Tendenz der verbundenen Knoten, geschlossene Dreiecke zu bilden.
  • Die durchschnittliche Straßenlänge gibt den Grad der Konnektivität an, um von einer Seite des Netzes zur anderen zu gelangen.

Die BeCrop-Indizes sind Indikatoren zur Bewertung des Gesundheitszustands von Böden auf der Grundlage metagenomischer Daten, wie sie von Acedo et al. Diese Indikatoren bewerten relevante Merkmale im Zusammenhang mit den Bodengesundheit die vom Stoffwechselpotenzial bis hin zur Biokontrolle und Hormonschätzung reichen.

Die zugrunde liegenden Datenbanken leiten die Anpassung an Stress die auf mehreren Mechanismen beruhen: Abscisinsäure (ABA), 1-Aminocyclopropan-1-carboxylat (ACC)-Desaminase, Exopolysaccharid (EPS)-Produktion, Schwermetall-Solubilisierung, Salicylsäure, Salztoleranz und Siderophorproduktion.

Darüber hinaus bieten sie eine potenzielle Hormonproduktion basierend auf der Produktion von Cytokininen, Gibberellin und IAA. Die Häufigkeit aller potenziellen Mechanismen basiert auf der Kombination relevanter prokaryotischer und pilzlicher Häufigkeiten und wird mit einem Index von 1 bis 6 skaliert, wobei 1 eine geringe Häufigkeit und 6 eine hohe Häufigkeit in der jeweiligen Bodenprobe anzeigt.

Zögern Sie nicht, sich an Tiloom Technological Solutions zu wenden, um einen dieser Tests durchzuführen und Ihrem Produkt einen endgültigen Impuls zu geben.

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