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ANALISI DEL SUOLO E DEI MICRORGANISMI

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Javier Méndez Lorente
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Indice dei contenuti: ANALISI DEL SUOLO E DEI MICRORGANISMI

Il crescente interesse per la microbiologia del suolo è dovuto al contributo dei microrganismi alla produttività e alla sostenibilità dell'agricoltura. La consapevolezza dei ricercatori, dei produttori rurali e delle aziende produttrici di input biologici sull'importanza dell'attività biologica per l'agricoltura ha influenzato la creazione e l'adattamento di tecniche e strumenti che consentono di ampliare le conoscenze.
sui microrganismi.

FASE 1. Estrazione del DNA e preparazione delle librerie.

  1. L'estrazione del DNA è stata eseguita con il kit DNeasy PowerLyzer PowerSoil di Qiagen (Hilden, Germania).
  2. BeCrop utilizza primer personalizzati per l'amplificazione PCR specificamente mirati alla regione 16S rRNA V4 e alla regione ITS1.
  3. Gli ampliconi vengono purificati utilizzando il kit KAPA Pure Beads (Roche, Basilea, Svizzera), mentre la corretta amplificazione di 16S e ITS viene valutata mediante gel di agarosio.
  4. I prodotti PCR purificati vengono quindi sottoposti alla preparazione delle librerie, seguendo un protocollo Illumina PCR in due fasi.
  5. Il DNA viene quindi quantificato utilizzando un fluorimetro Qubit con il kit di analisi Qubit HS 500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).
  6. Infine, le librerie vengono sequenziate su uno strumento Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, CA, USA) utilizzando letture 2 × 251 paired-end.

FASE 2. Elaborazione bioinformatica

  1. I primer vengono rimossi dalle letture appaiate utilizzando Cutadapt.
  2. Le letture rifilate vengono quindi unite con una sovrapposizione minima di 100 nucleotidi.
  3. Le sequenze vengono quindi filtrate per la qualità utilizzando l'errore atteso con un valore massimo di 1,0.
  4. Dopo una pre-elaborazione di qualità, le letture con differenze di singolo nucleotide vengono raggruppate iterativamente per formare le ASV (amplicon sequencing variants) utilizzando Swarm.
  5. Successivamente, le chimere de novo e i singleton rimanenti vengono rimossi.
  6. Infine, la tassonomia è stata assegnata dall'ASV utilizzando un allineamento globale con un'identità di 97% rispetto a un database di riferimento curato di SILVA 138.1 per le sequenze 16S e UNITE 8.3 per le sequenze ITS.

FASE 3. Calcolo degli indici del microbioma e delle proprietà della rete.

Le proprietà della rete locale sono state determinate seguendo la procedura descritta da Ortiz-Alvarez et al:

  1. Le reti di comunità microbiche per i campioni 16S e ITS sono state costruite in modo indipendente seguendo la metodologia riportata in una precedente pubblicazione.
  2. La meta-rete di presenza-assenza con tutti i campioni viene costruita utilizzando conteggi rarefatti e le coppie ASV, che si verificano con una frequenza significativamente più alta o più bassa del previsto, vengono conservate e viene determinata la rete di co-occorrenza o co-esclusione, rispettivamente.
  3. Le proprietà della rete locale per entrambi i marcatori sono calcolate sia per la co-occorrenza che per la co-esclusione: modularità, transitività e lunghezza media del percorso.
  • Il modularità descrive la separazione tra gruppi di microrganismi (moduli) che tendono a coesistere o spesso a escludersi a vicenda in specifiche nicchie ecologiche.
  • Il transitività (coefficiente di raggruppamento) misura la tendenza dei nodi connessi a formare triangoli chiusi.
  • Il lunghezza media della strada quantifica il grado di connettività per andare da un lato all'altro della rete.

Il Indici BeCrop sono indicatori utilizzati per valutare lo stato di salute dei suoli sulla base di dati metagenomici come descritto da Acedo e altri. Questi indicatori valutano le caratteristiche rilevanti relative al salute del suolo che vanno dal potenziale metabolico al biocontrollo e alle stime ormonali.

I database sottostanti deducono il adattamento allo stress basati su diversi meccanismi: acido abscisico (ABA), 1-aminociclopropano-1-carbossilato (ACC) deaminasi, produzione di esopolisaccaridi (EPS), solubilizzazione dei metalli pesanti, acido salicilico, tolleranza al sale e produzione di siderofori.

Inoltre, offrono un potenziale produzione di ormoni basati sulla produzione di citochinine, gibberelline e IAA. Tutte le abbondanze dei potenziali meccanismi si basano sulla combinazione delle abbondanze procariotiche e fungine e sono scalate su un indice da 1 a 6, dove 1 indica bassa abbondanza e 6 indica alta abbondanza nel rispettivo campione di suolo.

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