طقم التشخيص النباتي بتفاعل البوليميراز المتسلسل. تشخيص أمراض العشب عن طريق الفحص المجهري وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

تقدم هذه المقالة لمحة عامة عن منهجية تشخيص أمراض العشبالذي يفحص فعالية طقم التشخيص النباتي بتفاعل البوليميراز المتسلسل المتسلسل PCR من تيلوم. حللت الدراسة عشب الجاودار المعمر المصاب من حقل رياضي في نادي ليستر لكرة القدم بواسطة الفحص المجهري والتقنية الجزيئية. بدأت العملية بالمعاينة البصرية في الحقل والفحص المجهري، واختتمت التحليل بواسطة تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي. ونتيجة لذلك، تم استبعاد 11 مسببًا من مسببات الأمراض الشائعة في موسم البرد، مع تحديد أربعة مسببات إيجابية على مستويات مختلفة من العدوى، من إيجابية ضعيفة إلى إيجابية قوية. وترد أدناه مناقشة نتائج هذه الطرق.

الجزء السفلي من سطح العشب الرياضي. 

تم قص عشب الريجراس المعمر 100 % قيد البحث عدة مرات في الأسبوع بمعدل 25 مم (فعلي). في الأسبوع السابق تم استخدام حوالي 50 كجم ن/هكتار و15 كجم ف/هكتار و45 كجم ك/هكتار مع حمض أميني وطحالب. خضع هذا الحقل لحوالي 6 ساعات من التدريب على كرة القدم أسبوعياً.

تحليل الميكروسكوب

موقع للعدوى. إصابة جزازة العشب المعمر من الجانب السفلي للورقة.

عدوى وتراجع عشبة الريجراس دائمة الخضرة ذات الأوراق المقطوعة تحت المجهر التشريح. يبدو أن الآفات الناجمة عن القص هي موقع للذبول والعدوى. يشير الاسوداد والاصفرار إلى علامات الإصابة بالعدوى في الأوراق.

ولوحظ اصفرار والتواء الأوراق على العديد من أوراق الريجراس دائمة الخضرة التي تم فحصها. وكان الأكثر وضوحاً هو اضمحلال الأوراق من الطرف مع وجود هياكل رمادية مائلة للبياض على الأوراق المحتضرة والذابلة والملتوية من عشب الريجراس الدائم الخضرة.

وتحت المجهر الضوئي، لوحظت البنى الخيطية عن كثب تحت المجهر الضوئي.

لوحظت عدوى بكتيرية خيطية ملطخة 40x للرؤية داخل أوراق عشب الجاودار المعمر.

الخيوط البكتيرية ملطخة في 25x بالأزرق الأنيلين الأزرق للعرض داخل ورقة الجاودار دائمة الخضرة. إن البكتيريا خيطي لم يتفرع ويجري طوليًا على طول الورقة. 

بكتيريا خيطية بمعدل 40 ضعفاً ملطخة بالأزرق الأنيلين داخل ورقة عشب الجاودار المعمرة. البكتيريا المتجمعة غير متفرعة وليس لها أقسام واضحة (أقسام/جدران فاصلة).

على نبات مختلف داخل المنطقة المأخوذة منها العينة، تحت مجهر التشريح، تظهر الفطريات القطنية بارزة من مادة الأوراق المحتضرة من عشب الريجراس المعمرة.

خيوط متفرعة، ملطخة باللون الأزرق تحت مجهر ضوئي 25x.

خيوط خبيثة متفرعة ملطخة بالأزرق داخل عشبة الجاودار المعمرة؛ ولسوء الحظ، لوحظ تفرع غير مركز قليلاً على شكل حرف T.

نتائج الفحص المجهري

كشفت أعمال الفحص المجهري الضوئي عن وجود عدوى بكتيرية خيطية خيطية محتملة، على سبيل المثال، ربما تكون علامات مبكرة على البكتيريا الزرقاء (عدوى الطحالب). على نبات مختلف من نفس العينة، لوحظت الفطريات البارزة عن كثب مع تفرع ملحوظ على شكل حرف T. من خصائص الريزوكتونيا الجذرية spp. ولا يمكن توضيح ذلك إلا بإجراء المزيد من التحليل الجزيئي. 

تحليل الحمض النووي

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو تقنية جزيئية يمكن استخدامها للكشف عن وجود الحمض النووي المستهدف. وهو دقيق للغاية ويمكن تحديد الكشف بكميات صغيرة جداً. نستخدم هذه التقنية الآن لتحديد وجود مسببات الأمراض النباتية/العشبية. ويمكن أن تكون هذه الممرضات فطرية أو غير فطرية (مثل البكتيريا). ويلزم وجود قالب الحمض النووي المستهدف (المعروف باسم البادئ أو المخزن المؤقت) لتضخيم الحمض النووي. تستخدم هذه الطريقة بادئات متعددة للحمض النووي في تفاعل البوليميراز المتسلسل. ويُعرف ذلك باسم تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد.

شملت مسببات أمراض الحمض النووي التي تم اختبارها ثنائي القطبين spp, كلاريريديا spp, Colletotrichum spp., Drechslera spp., Fusarium بوي , جيومانومانوميسيسيس spp, Laetisaria fuciformis , ميكرودوتشيوم نيفال , البيريسولاريا الجريزية (Pyricularia grisea) , بيثيوم spp, ريزوكتونيا الحبوب الجذرية , ر. سولاني , سكليروفثورا ماكروسبورا. , زانثوموناس ترانسفيروسينس , المتاهة spp. 

أو المعروفة باسم: بقعة الأوراق (ثنائي القطبين & دريشليرا spp)، وبقع الدولار، والأنثراكنوز، والفيوزاريوم، وبقعة التزهير (فطر البق)، وبقعة الخيط الأحمر، وبقعة الميكرودوشيوم، وبقع الأوراق الرمادية، والباثيوم (التخميد)، والبقعة الصفراء، والبقعة البنية، والخرمة الصفراء (العفن الفطري الناعم)، والذبول البكتيري، واللفحة السريعة(البذاءة السريعة). 

أُخذت عينات من ست نباتات ريجراس معمرة وتم إعدادها لمزيد من التحليل الجنائي عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

تم تقطيع أوراق عشب الجاودار المعمر والبراعم والجذور وتجانسها لتحليلها.

كانت الخطوة الأولى لاستخلاص الحمض النووي هي تحلل الخلايا من مادة الأوراق والبراعم والجذور.

النبات المستخلص وتركيز الحمض النووي لمسببات الأمراض.

تم غسل الحمض النووي المستخلص واستخراجه استعدادًا لتضخيم الحمض النووي عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل.

الأنابيب المجهرية التي تحتوي على محلول تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لمسببات الأمراض الخمسة عشر مع التحكم في التضخيم.

تم الكشف عن أربعة مسببات أمراض إيجابية عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي: ميكرودوشيوم نيفال (رقعة الفيوزاريوم)، وبيثيوم سبيثوم (التخميد)، وريزوكتونيا سولاني (رقعة بنية)، وريزوككتونيا سولاني (ر. سيراليس (ر. سيراليس) (رقعة صفراء). تم اكتشاف مستوى عالٍ من R. cerealis.

نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل

نظرًا لأن الحمض النووي الذي تم تحليله هنا لم يتضمن البكتيريا الزرقاء لم يكن من الممكن تأكيد وجودها. ومع ذلك، فقد استبعدت تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد هذه 11 مسببًا آخر للأمراض من العشب الذي تم أخذه من العينة. على الرغم من عدم وجود أعراض مرضية واضحة يمكن أن تكون مرتبطة ببقعة الميكرودوشيوم/فيوزاريوم ( ميكرودوتشيوم نيفال ) o بيثيوم خيوط خبيثة مميزة للرقعة الصفراء ( ريزوكتونيا الحبوب الجذرية ) أو الرقعة البنية ( ر. سولاني ) في وقت أخذ العينة. وقدم تحليل الحمض النووي دليلاً على وجوده. ومن المثير للاهتمام أنه كان يشتبه في أن مرض البقع الصفراء هو سبب ظهور البقع في الصيف والخريف السابقين (يوليو - أكتوبر) من عامي 2021 و2023. ومن المعروف أن الريزوكتونيا الجذرية في فصل الشتاء داخل العشب أو حطام النبات. ونظراً لأن عينات الجاودار التي تم أخذها شملت أوراقاً وجذوراً وبراعم ومواد أوراق متحللة، فمن المحتمل أن تكون الفطريات المتراكمة في الشتاء قد دخلت في التفاعل.

الأعراض النموذجية لعدوى البقع الصفراء التي ظهرت في أشهر صيف 2022 و2023 (هذه الصورة من أغسطس/آب 2023) في الموقع.

التوصيات

من المهم ملاحظة أنه تم تحديد العديد من مسببات الأمراض في هذه العينات. في العادة، نقوم عادةً بتسمية المرض ومناقشته عندما نلاحظ العلامات والأعراض في العشب. في هذه الحالة هناك ما لا يقل عن أربعة أو خمسة مسببات للأمراض. قد تكون مسببات الأمراض التي تم تحديدها قد تسببت في الاصفرار والموت مع عدوى بكتيرية ثانوية. وربما يكون هذا الأمر نموذجياً، وربما يكون التفاعل بين هذه الممرضات والاضطرابات الأخرى مثل الطحالب له تأثير مشترك على حالة العشب؛ وربما يتطلب هذا الأمر مزيداً من التحقيق.

قد تتضمن التوصيات الخاصة بالسيطرة على هذه التهديدات لصحة العشب وحالته مراجعة الأساليب البيولوجية والفيزيائية. على سبيل المثال، من المعروف أن أنواعًا معينة من البكتيريا بيسيلوس التحكم الريزوكتونيا الجذرية . هناك مجموعة من المنتجات المتاحة في سوق العشب. قد يكون للتدخل المبكر في هذا الوقت فعالية أكبر، كما هو معتاد في المكافحة البيولوجية. بالنسبة للعدوى بواسطة البكتيريا الزرقاء يتم إجراء تطبيق متسلسل للأشعة فوق البنفسجية-ج على أساس أن الطحالب حساسة للأشعة فوق البنفسجية. يمكن أيضًا مراجعة استخدام وجرعة النيتروجين والفوسفور لضمان مستويات كافية. 

يعد تشخيص أمراض العشب خطوة مهمة في إدارة العشب بكفاءة وفعالية. سواء كان ذلك بتخصيص الموارد والميزانية، أو العمل بكفاءة وفعالية لحماية البيئة مع الحفاظ على جودة أسطح اللعب. نحن نعلم أن الإدارة الوقائية للأمراض غالبًا ما تكون فعالة من حيث التكلفة وتوفر أسطح لعب ذات جودة عالية. 

في حين أن الفحص المجهري سمح بإجراء فحص واسع النطاق للعدوى، إلا أنه لم يتمكن من تحديد العامل الممرض بدقة. كان الفحص المجهري فرصة للتحقق من مواقع العدوى وملاحظة أي خصائص للفطر الممرض، كما هو موضح في الأوراق المقطوعة التي تعرضت للتلف في جزازة العشب وبداية الإصابة. كانت هذه خطوة أولية مهمة نحو التحقيق في السبب المحتمل، إذا ما تطلب الأمر تحديداً دقيقاً. 

كانت تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل دقيقة في الكشف عن مسببات الأمراض الموجودة، سواء كانت هذه الممرضات مصابة بأعراض أو كامنة تصيب العشب. وربما وفرت مؤشرًا تنبؤيًا تقريبًا لاحتمال وجود المرض في المستقبل. وهذا يعني أنه يمكن البدء في وضع خطة علاج متكاملة لمسببات الأمراض المحددة هذه ومراقبتها باستمرار. 

إن أفضل طريقة للتعرف الدقيق على مسببات الأمراض في مرحلة الأعراض أو مرحلة الخمول هي التشخيص الدقيق لمسببات الأمراض في مرحلة الأعراض أو مرحلة الخمول باستخدام الفحص المجهري والتحليل الجزيئي، كما هو موضح في دراسة الحالة هذه. من المرجح أن توفر هذه التقنيات لحارس الغطاء النباتي أفضل المعلومات اللازمة لاتخاذ إجراءات فورية وتخطيط إدارة الأمراض. في جوهرها، يبدو أن هذه هي أفضل الخطوات الأولى للإدارة الاستباقية والوقائية المتكاملة للأمراض. 

اتصل ب Tiloom على info@tiloom.com وفي أقل من 48 ساعة ستحصل على الإجابة من خلال تحليل التشخيص qPCR.