Análise de solo e microorganismos
FOTO · TILOOM
O crecente interese pola microbioloxía do solo débese á contribución dos microorganismos á produtividade e sustentabilidade agrícola. A concienciación de investigadores, produtores rurais e empresas de insumos biolóxicos sobre a importancia da actividade biolóxica para a agricultura influíu na creación e adaptación de técnicas e ferramentas que permiten ampliar o coñecemento
sobre os microorganismos.
ETAPA 1. Extracción de ADN e preparación de bibliotecas.
- A extracción de ADN realízase co kit DNeasy PowerLyzer PowerSoil de Qiagen (Hilden, Alemaña).
- BeCrop utiliza cebadores personalizados para a amplificación por PCR dirixidos específicamente á rexión 16S rRNA V4 e á rexión ITS1.
- Os amplicóns purifícanse utilizando o kit KAPA Pure Beads (Roche, Basilea, Suíza), mentres que a amplificación correcta de 16S e ITS se avalía utilizando xel de agarosa.
- Os produtos de PCR purificados sométense logo á preparación da biblioteca, seguindo un protocolo de PCR Illumina de dous pasos.
- A continuación, cuantifícase o ADN utilizando un fluorómetro Qubit co kit de ensaio Qubit HS 500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.).
- Finalmente, as bibliotecas secuénciase nun instrumento Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) utilizando 2 × 251 lecturas de extremos emparellados.
ETAPA 2. Procesamento Bioinformático
- Os cebadores elimínanse das lecturas de pares utilizando Cutadapt.
- Logo, as lecturas recortadas fusiónanse cunha superposición mínima de 100 nucleótidos.
- A continuación, as secuencias fíltranse por calidade utilizando o erro esperado cun valor máximo de 1,0.
- Despois dun preprocesamento de calidade, as lecturas con diferenzas dun só nucleótido agrúpanse iterativamente para formar ASV (variantes de secuenciación de amplicóns) utilizando Swarm.
- Posteriormente elimínanse as quimeras de novo e os singletons restantes.
- Finalmente, a taxonomía asígnase a partir de ASV utilizando un aliñamento global cunha identidade do 97% fronte a unha base de datos de referencia curada de SILVA 138.1 para secuencias 16S e UNITE 8.3 para secuencias ITS.
ETAPA 3. Cálculo de índices de microbiomas e propiedades de rede.
As propiedades da rede local determínanse seguindo o procedemento descrito por Ortiz-Alvarez et al:
- Constrúense redes comunitarias microbianas para mostras 16S e ITS de forma independente seguindo a metodoloxía informada nunha publicación anterior.
- A meta-rede de presenza-ausencia con todas as mostras constrúese utilizando reconteos enrarecidos e os pares ASV, que ocorren cunha frecuencia significativamente maior ou menor da esperada, preservouse e determinouse a rede de coocorrencia ou coexclusión, respectivamente.
- As propiedades da rede local para ambos os marcadores calcúlanse tanto para a coocorrencia como para a coexclusión: modularidade, transitividade e lonxitude media do camiño.
- A modularidade describe a separación entre grupos de microorganismos (módulos) que tenden a coexistir ou excluírse con frecuencia en nichos ecolóxicos específicos.
- A transitividade (coeficiente de agrupamento) mide a tendencia dos nodos conectados a formar triángulos pechados.
- A lonxitude media do camiño cuantifica o grao de conectividade para ir dun lado da rede a outro.
Os índices BeCrop son indicadores utilizados para avaliar o estado de saúde dos solos baseándose en datos metaxenómicos tal como describen Acedo et al. Estes indicadores avalían trazos relevantes relacionados coa saúde do solo que van desde o potencial metabólico ata o biocontrol e as estimacións hormonais.
As bases de datos subxacentes inferen a adaptación ao estrés baseándose en varios mecanismos: ácido abscísico (ABA), 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) desaminasa, produción de exopolisacáridos (EPS), solubilización de metais pesados, ácido salicílico, tolerancia á sal e produción de sideróforos.
Ademais, ofrecen unha produción potencial de hormonas baseada na produción de citoquininas, xiberelina e IAA. Todas as abundancias de mecanismos potenciais baséanse na combinación de abundancias de procarióticos e fungos relevantes e escálanse a un índice de 1 a 6, onde 1 indica baixa abundancia e 6 indica alta abundancia na mostra de solo respectiva.
Non dubides en contactar con Tiloom Soluciones Tecnológicas para realizar un destes tests e darlle un impulso definitivo ao teu produto.
