Fitodiagnosi PCR Kita. Soropilaren gaixotasunen diagnostikoa mikroskopiaren eta polimerasaren kate-erreakzioaren (PCR) bidez

Artikulu honek soropilaren gaixotasunen diagnostiko-metodologiaren ikuspegia eskaintzen du, non Tiloomen Fitodiagnosi PCR Kitaren eraginkortasuna aztertzen den. Ikerketan Leicester Football Club-eko kirol-zelai bateko raigras iraunkor infektatua aztertu zen mikroskopiaren eta teknika molekular baten bidez. Prozesua zelaiko ikuskapen bisualekin eta mikroskopiarekin hasi zen, eta analisia denbora errealeko PCR kuantitatiboarekin amaitu zen. Horren emaitza gisa, neguko estazioko 11 patogeno ohiko baztertu ziren, lau identifikazio positibo infekzio-maila desberdinetan, positibo ahulatik indartsura. Metodo hauen aurkikuntzak jarraian aztertzen dira.

Kirol-soropilaren gainazalaren testuingurua. 

Ikertzen ari zen %100 raigras iraunkorreko soropila astean hainbat aldiz ebaki zen 25 mm-ra (errealak). Aurreko astean 50 kg N/ha, 15 Kg P/ha, 45 kg K/ha inguru aplikatu ziren aminoazido eta algekin. Zelai honek astean 6 ordu inguruko futbol-entrenamendua jasaten zuen.

Mikroskopio-analisia

Infekziorako gune bat. Raigras iraunkorrean soropil-ebakigailuak eragindako lesioa, orriaren azpialdetik.

Raigras iraunkorreko orri ebakiaren infekzioa eta atzerako heriotza disekzio-mikroskopioan. Soropil-ebakigailuak eragindako lesioak atzerako heriotzaren eta infekzioaren gune gisa agertzen dira. Beltzitzeak eta kolore horixkak infektatutako orri-materialaren zeinuak adierazten zituzten.

Ikuskatutako raigras iraunkorreko hainbat orritan orri horixkak eta bihurrituak behatu ziren. Nabarmenagoa izan zen orrien heriotza muturretik hasita, raigras iraunkorreko orri hilzorian, zimelduta eta bihurrituetan gris-zuriska koloreko egiturekin.

Mikroskopio optiko batean, egitura iragazkiak hurbilagotik behatu ziren.

Infekzio bakteriano iragazkia behatu zen, 40x-ra tindatua, raigras iraunkorreko orrien barruan ikusgarritasun handiagoa izateko.

Harizpi bakterianoak anilina urdinarekin 25x-ra tindatuak raigras iraunkorreko orriaren barruan bistaratzeko. Bakterio iragazkiak ez ziren adarkatzen eta orriaren luzeran zehar luzetara zebiltzan. 

Bakterio iragazkiak 40x-ra anilina urdinarekin tindatuak raigras iraunkorreko orri baten barruan. Bildutako bakterioak ez dira adarkatzen eta ez dute septo agerikorik (zati/horma banatzaileak).

Lagindutako eremuko landare ezberdin batean, disekzio-mikroskopio batean, raigras iraunkorreko orri hilzorien materialetik ateratzen den mizelio kotoitsua ikusten da.

Hifa adarkatuak, urdinez tindatuak mikroskopio optikoan 25x

Hifa adarkatuak urdinez tindatuak raigras iraunkorraren barruan; zoritxarrez, T formako adarkatze apur bat fokurik gabea behatu zen.

Mikroskopiaren emaitzak

Mikroskopia optikoko lanak ohiko izan daitekeen infekzio bakteriano iragazki bat identifikatu zuen, adibidez, agian zianobakterio baten (alga-infekzioa) hasierako zeinuak. Laginaren beraren landare ezberdin batean, ateratzen zen mizelioa hurbilagotik behatu zen, T formako adarkatze behagarriekin. Rhizoctonia spp. espezieen ezaugarri. Analisi molekular gehiagorekin soilik argitu ahal izango litzateke hau. 

ADN analisia

Polimerasaren kate-erreakzioa (PCR) xede-ADNaren presentzia detektatzeko erabil daitekeen teknika molekularra da. Oso zehatza da eta detekzioa oso kantitate txikietan identifika daiteke. Orain teknika hau erabiltzen dugu landare/soropil patogenoen presentzia identifikatzeko. Patogeno hauek onddo-patogenoak edo onddo ez-patogenoak izan daitezke (adibidez, bakterianoak). Xede-ADNaren txantiloia (hasle edo buffer izenez ezagutzen dena) ADNaren anplifikaziorako beharrezkoa da. Metodo honek hainbat ADN hasle erabiltzen ditu PCRan. Hau PCR anizkoitza bezala ezagutzen da.

Aztertutako ADN patogenoen artean zeuden: Bipolaris spp., Clarireedia spp., Colletotrichum spp., Drechslera spp., Fusarium poae , Gaeumannomyces spp., Laetisaria fuciformis , Microdochium nivale , Pyricularia grisea , Pythium spp., Rhizoctonia cerealis , R. solani , Sclerophthora macrospora. , Xanthomonas translucens , Labyrinthula spp. 

Edo ohiko izenez ezagutzen direnak: Leaf spot (Bipolaris & Dreschlera spp), dollar spot, antraknosia, Fusarium, take-all patch, red thread (hari gorria), Microdochium patch, grey leaf spot, Pythium (damping off), yellow patch, brown patch, yellow tuft (mildiu belusatua), bacterial wilt (zimeltze bakterianoa), Rapid blight (izurri azkarra). 

Raigras iraunkorreko sei landareren laginak hartu ziren eta polimerasaren kate-erreakzioaren (PCR) bidezko azterketa forense gehiagorako prestatu ziren.

Raigras iraunkorreko orri, kimu eta sustraien materiala moztu eta homogeneizatu zen aztertzeko.

ADN erauzketaren hasierako urratsa orri, kimu eta sustraien materialaren zelulen deskonposizioa izan zen.

Erauzitako landarea eta ADN patogenoaren kontzentratua.

Erauzitako ADNa garbitu eta eluitu zen PCRaren bidezko ADN anplifikaziorako prestatzeko

Anplifikazio-kontrola duten 15 patogenoen PCR erreakzio-disoluzioa duten mikrohodiak.

Lau patogeno positiboki detektatu ziren denbora errealeko PCR kuantitatiboaren bidez: Microdochium nivale (Fusarium patch), Pythium spp. (damping off), Rhizoctonia solani (brown patch) eta R. cerealis (Yellow Patch). R. cerealis-en maila altua detektatu zen.

PCRaren emaitzak

Hemen aztertutako ADNak Cyanobacteria spp. ez zituenez, ezin izan zen haien presentzia baieztatu. Hala ere, PCR anizkoitzeko teknika honek lagindutako soropiletik beste 11 patogeno baztertu zituen. Microdochium/Fusarium Patch ( Microdochium nivale ) edo Pythium -ekin lotu zitezkeen gaixotasun-sintoma agerikorik ez zegoen arren, laginketaren unean mikroskopiaren bidez Yellow Patch ( Rhizoctonia cerealis ) edo Brown Patch ( R. solani ) gaixotasunen hifa bereizgarriak behatu ziren. ADN analisiak haien presentziaren frogak eman zituen. Bitxia bada ere, Yellow Patch gaixotasuna susmatzen zen 2021eko eta 2023ko aurreko uda eta udazkeneko (uztaila-urria) orbanen kausa zela. Rizoktonia soropilaren edo landare-hondarren barruan negua igarotzen duela ezaguna da. Lagindutako raigrasak orriak, sustraiak, kimuak eta orrien material deskonposatua zituenez, litekeena da negua igaro zuten onddoak erreakzioan sartu izana.

Orban horiaren infekzioaren sintoma tipikoak, 2022ko eta 2023ko udako hilabeteetan gertatzen direnak (argazki hau 2023ko abuztukoa da) gunean.

Gomendioak

Garrantzitsua da adieraztea lagin hauetan hainbat patogeno identifikatu zirela. Normalean, gaixotasun bat izendatu eta eztabaidatzen dugu soropilean zeinuak eta sintomak behatzen ditugunean. Kasu honetan, gutxienez lau edo bost eragile patogeno daude tartean. Identifikatutako patogenoek horitzea eta atzerako heriotza eragin izan dezakete infekzio bakteriano sekundario batekin. Ziur aski, hau tipikoa da, eta patogeno hauen eta algen bezalako beste nahaste batzuen arteko elkarrekintzak soropilaren egoeran efektu konbinatua du; horrek ikerketa gehiago behar izango du ziur aski.

Soropilaren osasunerako eta egoerarako mehatxu hauek kontrolatzeko gomendioek ikuspegi biologikoen eta fisikoen berrikuspena izango lukete. Adibidez, Bacillus bakterio-espezie batzuek Rhizoctonia kontrolatzen dutela ezaguna da. Soropil-merkatuan hainbat produktu daude eskuragarri. Une honetan esku-hartze goiztiarra eraginkorragoa izan daiteke, kontrol biologikoetan ohikoa den bezala. Zianobakterioen infekziorako UV-C argiaren aplikazio sekuentziala egiten da, algak UV izpiekiko sentikorrak direlako premisaren pean. Nitrogenoaren eta fosforoaren aplikazioa eta dosia ere berrikus daitezke, maila nahikoak bermatzeko. 

Soropilaren gaixotasunen diagnostikoa urrats garrantzitsua da soropilaren kudeaketa eraginkor eta efizientean. Baliabideak eta aurrekontua esleitzeko, edo modu eraginkor eta efizientean jarduteko ingurumena babesteko eta aldi berean kalitatezko joko-gainazalak mantentzeko. Badakigu gaixotasunen kudeaketa prebentiboa errentagarria izan ohi dela eta kalitate onaren joko-gainazalak errazten dituela. 

Mikroskopiak infekzioaren ikerketa zabala ahalbidetu zuen arren, ezin izan zuen agente patogeno zehatza identifikatu. Ikuskapen mikroskopikoa aukera bat izan zen infekzio-guneak ikertzeko eta onddo patogenoaren edozein ezaugarri behatzeko, soropil-ebakigailuak kaltetutako orri ebakiekin eta infekzioaren hasierarekin erakusten den bezala. Hau urrats hasierako garrantzitsua izan zen kausa probable baten ikerketarantz, identifikazio zehatza behar bada. 

PCR teknika zehatza izan zen dauden patogenoak detektatzean, patogeno hauek soropila sintomatikoki edo ezkutuan infektatzen ari zirela ere. Baliteke etorkizuneko gaixotasun posibleen ia aurreikuspen-adierazle bat eskaini izana. Horrek esan nahi du patogeno espezifiko hauentzako tratamendu integratuen plan bat has eta etengabe monitoriza daitekeela. 

Patogenoen identifikazio zehatza fase sintomatikoan edo inaktiboan diagnostikatzeko modurik onena mikroskopia eta analisi molekularra erabiltzea da, kasu-azterketa honetan erakusten den bezala. Litekeena da teknika hauek greenkeeperrari berehalako neurriak hartzeko eta gaixotasunen kudeaketa planifikatzeko informaziorik onena ematea. Funtsean, hauek dira gaixotasunen kudeaketa integratu proaktibo eta prebentiborako lehen urrats onenak.

Jarri harremanetan Tiloomekin info@tiloom.com helbidean eta 48 ordu baino gutxiagoan erantzuna izango duzu qPCR diagnostiko-analisi baten bidez.