Kit de Fitodiagnosi PCR. Diagnòstic de malalties de la gespa mitjançant microscòpia i reacció en cadena de la polimerasa (PCR)

Aquest article ofereix una visió de la metodologia de diagnòstic de malalties de la gespa, en què s'analitza l'eficàcia del Kit de Fitodiagnosi PCR de Tiloom. A l'estudi es va analitzar raigràs perenne infectat d'un camp esportiu del Leicester Football Club mitjançant microscòpia i una tècnica molecular. El procés es va iniciar amb inspeccions visuals al camp i microscòpia, i l'anàlisi va concloure mitjançant PCR quantitativa en temps real. Com a resultat d'això es van descartar 11 patògens comuns de l'estació freda, amb quatre identificacions positives en diversos nivells d'infecció, des de positiu feble fins a fort. Les troballes d'aquests mètodes s'analitzen a continuació.

Context de la superfície de la gespa esportiva. 

La gespa 100 % raigràs perenne que s'estava investigant es tallava diverses vegades per setmana a 25 mm (reals). La setmana anterior es va aplicar al voltant de 50 kg N/ha, 15 Kg P/ha, 45 kg K/ha amb un aminoàcid i algues. Aquest camp va ser sotmès a unes 6 hores d'entrenament de futbol per setmana.

Anàlisi de microscopi

Un lloc per a la infecció. Lesió de la talladora de gespa en raigràs perenne des de l'envers de la fulla.

Infecció i mort regressiva de la fulla tallada de raigràs perenne sota el microscopi de dissecció. Les lesions causades per la talladora semblen ser un lloc de mort regressiva i infecció. L'ennegriment i el color groguenc van indicar signes de material foliar infectat.

Es van observar fulles groguenques i retorçades en diverses de les fulles de raigràs perenne inspeccionades. Més evident va ser la mort de les fulles des de la punta amb estructures de color gris blanquinós a les fulles moribundes, marcides i retorçades del raigràs perenne.

Sota un microscopi òptic, es van observar més de prop les estructures filamentoses.

Es va observar una infecció bacteriana filamentosa tenyida amb 40x per a una major visibilitat dins de les fulles de raigràs perenne.

Filaments bacterians tenyits a 25x amb blau d'anilina per a visualització dins de la fulla de raigràs perenne. Els bacteris filamentosos no es ramificaven i corrien longitudinalment al llarg de la fulla. 

Bacteris filamentosos a 40x tenyits amb blau d'anilina dins d'una fulla de raigràs perenne. Els bacteris agregats no es ramifiquen i no tenen septes aparents (seccions/parets divisòries).

En una planta diferent dins de l'àrea mostrejada, sota un microscopi de dissecció, es veu miceli cotonós visible que sobresurt del material de les fulles moribundes del raigràs perenne.

Hifes ramificades, tenyides de blau sota microscopi òptic 25x

Hifes ramificades tenyides de blau dins del raigràs perenne; malauradament, es va observar una ramificació en forma de T lleugerament desenfocada.

Resultats de microscòpia

El treball de microscòpia òptica va identificar una infecció bacteriana filamentosa potencialment comuna, per exemple, possiblement signes primerencs d'un cianobacteri (infecció per algues). En una planta diferent de la mateixa mostra, es va observar més de prop el miceli que sobresortia amb ramificacions observables en forma de T. Característica de Rhizoctonia spp. Només amb més anàlisis moleculars es podria dilucidar això. 

Anàlisi d'ADN

La reacció en cadena de la polimerasa (PCR) és una tècnica molecular que es pot utilitzar per detectar la presència d'ADN objectiu. És molt precisa i la detecció es pot identificar en quantitats molt petites. Ara utilitzem aquesta tècnica per identificar la presència de patògens de plantes/gespa. Aquests patògens poden ser fúngics o no fúngics (per exemple, bacterians). La plantilla de l'ADN objectiu (coneguda com a encebador o buffer) és necessària per a l'amplificació de l'ADN. Aquest mètode utilitza múltiples encebadors d'ADN en la PCR. Això es coneix com a PCR múltiple.

Els patògens d'ADN analitzats van incloure: Bipolaris spp., Clarireedia spp., Colletotrichum spp., Drechslera spp., Fusarium poae , Gaeumannomyces spp., Laetisaria fuciformis , Microdochium nivale , Pyricularia grisea , Pythium spp., Rhizoctonia cerealis , R. solani , Sclerophthora macrospora. , Xanthomonas translucens , Labyrinthula spp. 

O comunament conegudes com: Leaf spot (Bipolaris & Dreschlera spp), dollar spot, antracnosi, Fusarium, take-all patch, red thread (fil vermell), Microdochium patch, grey leaf spot, Pythium (damping off), yellow patch, brown patch, yellow tuft (míldiu vellutat), bacterial wilt (marciment bacterià), Rapid blight (tizón ràpid). 

Es van prendre mostres de sis plantes de raigràs perenne i es van preparar per a anàlisis forenses addicionals mitjançant reacció en cadena de la polimerasa (PCR).

El material de fulles, brots i arrels del raigràs perenne es va tallar i homogeneïtzar per a la seva anàlisi.

El pas inicial de l'extracció d'ADN va ser la descomposició de les cèl·lules del material de fulles, brots i arrels.

La planta extreta i el concentrat d'ADN patogen.

L'ADN extret es va rentar i eluir en preparació per a l'amplificació de l'ADN mitjançant PCR

Microtubs que contenen solució de reacció de PCR per als 15 patògens amb control d'amplificació.

Es van detectar positivament quatre patògens mitjançant PCR quantitativa en temps real: Microdochium nivale (Fusarium patch), Pythium spp. (damping off), Rhizoctonia solani (brown patch) i R. cerealis (Yellow Patch). Es va detectar un nivell elevat de R. cerealis.

Resultats de la PCR

Com que l'ADN analitzat aquí no incloïa Cyanobacteria spp. no va ser possible confirmar-ne la presència. Tanmateix, aquesta tècnica de PCR múltiple va descartar 11 patògens més de la gespa mostrejada. Encara que no hi havia símptomes òbvis de malaltia que poguessin estar associats amb Microdochium/Fusarium Patch ( Microdochium nivale ) o Pythium , es van observar mitjançant microscòpia hifes característiques de Yellow Patch ( Rhizoctonia cerealis ) o Brown Patch ( R. solani ) en el moment del mostreig. L'anàlisi d'ADN va proporcionar evidència de la seva presència. Curiosament, es sospitava que la malaltia de Yellow Patch era la causa de les taques de l'estiu i la tardor anteriors (juliol-octubre) de 2021 i 2023. Se sap que la rizoctònia passa l'hivern dins de la gespa o les restes de plantes. Com que el raigràs mostrejat incloïa fulles, arrels, brots i material descompost de les fulles, és probable que a la reacció s'incloguessin fongs que van passar l'hivern.

Símptomes típics d'infecció per la taca groga que es produeixen als mesos d'estiu de 2022 i 2023 (aquesta foto és d'agost de 2023) al lloc.

Recomanacions

És important assenyalar que es van identificar múltiples patògens en aquestes mostres. Normalment, nomenem i discutim una malaltia quan observem signes i símptomes a la gespa. En aquest cas intervenen almenys quatre o cinc agents patògens. Els patògens identificats poden haver causat l'engroguiment i la mort regressiva amb una infecció bacteriana secundària. Possiblement, això sigui típic, i la interacció entre aquests patògens i altres trastorns com les algues està tenint un efecte combinat en la condició de la gespa; això probablement requereixi més investigació.

Les recomanacions per controlar aquestes amenaces a la salut i la condició de la gespa inclourien la revisió d'enfocaments biològics i físics. Per exemple, se sap que certes espècies de bacteris Bacillus controlen Rhizoctonia . Hi ha una gamma de productes disponibles al mercat de la gespa. La intervenció primerenca en aquest moment pot tenir una major eficàcia, com és habitual en els controls biològics. Per a la infecció per cianobacteris es realitza una aplicació seqüencial de llum UV-C, sota la premissa que les algues són sensibles als raigs UV. També es podran revisar l'aplicació i la dosi de nitrogen i fòsfor, amb la finalitat de garantir nivells suficients. 

El diagnòstic de malalties de la gespa és un pas important en el maneig eficient i eficaç de la gespa. Ja sigui assignant recursos i pressupost, o actuant de manera eficient i efectiva per protegir el medi ambient i alhora mantenir superfícies de joc de qualitat. Sabem que el maneig preventiu de malalties sol ser rendible i facilita superfícies de joc de bona qualitat. 

Si bé la microscòpia va permetre una investigació àmplia de la infecció, no va poder identificar l'agent patogen exacte. La inspecció microscòpica va ser una oportunitat per investigar els llocs d'infecció i observar qualsevol característica del fong patogen, com es mostra amb les fulles tallades danyades per la talladora de gespa i l'inici de la infecció. Aquest va ser un pas inicial important cap a la investigació d'una causa probable, en cas que es requereixi una identificació precisa. 

La tècnica de PCR va ser precisa en la detecció de patògens presents, tant si aquests patògens estaven infectant la gespa de manera simptomàtica com latent. És possible que hagi proporcionat un indicador gairebé predictiu de possibles malalties futures. Això significa que es pot iniciar i monitoritzar contínuament un pla integrat de tractaments per a aquests patògens específics. 

La millor manera de diagnosticar la identificació precisa de patògens en la fase simptomàtica o inactiva és utilitzant microscòpia i anàlisi molecular, com es mostra en aquest estudi de cas. És probable que aquestes tècniques donin al greenkeeper la millor informació per prendre mesures immediates i planificar el maneig de malalties. En essència, aquests semblen ser els millors primers passos per a una gestió integrada de malalties proactiva i preventiva.

Contacteu amb Tiloom a info@tiloom.com i en menys de 48 hores tindreu la resposta a través d'una anàlisi de diagnòstic qPCR.