PhytAlert Turf e a técnica de qPCR: clave para as enfermidades do céspede
FOTO · TILOOM
Desde hai décadas, a técnica de qPCR é unha técnica de uso amplamente estendido e indispensable para laboratorios tanto médicos como biolóxicos. Hoxe en día é popularmente coñecida en todo o mundo, a técnica de detección para a COVID-19 e é a clave para un céspede san, unha nova forma de estudar o céspede e que Tiloom presenta na industria do céspede co innovador kit PhytAlert Turf de Microgaia Biotech.
Ábrense novas formas de estudar a saúde dos nosos céspedes grazas á qPCR.
Ábrense novas formas de estudar a saúde dos nosos céspedes no mundo grazas á tecnoloxía levada á práctica co noso novo Kit Phytfieldlab
Esta técnica baséase na amplificación exponencial de moléculas de ADN, mediante o uso da enzima ADN polimerase termoestable. As súas siglas son PCR: Polymerase Chain Reaction (reacción en cadea da polimerase). Agora é unha técnica accesible para que todos os campos poidan diagnosticarse con rapidez e precisión.
Agora podemos aplicar esta técnica para coñecer o estado fitosanitario das nosas superficies deportivas, é dicir, podemos identificar os microorganismos patoxénicos, tanto na planta como no solo, antes de que estes cheguen a producir a enfermidade. Este feito permite ao greenkeeper tomar decisións acerca do tipo de tratamento a utilizar, valorando a necesidade real da súa aplicación, aforrando custos, optimizando tratamentos e diminuíndo a presenza destes compostos químicos no solo.
Co KIT PhytAlert Turf podes diagnosticar o céspede con rapidez e precisión.
As principais vantaxes son:
- Control e seguimento: permite anticiparse antes de que aparezan os primeiros síntomas fitopatoxénicos.
- Prevención: análise do estado do solo antes do establecemento do céspede ou de calquera cultivo.
- Certificación de tepe libre de patóxenos previa á instalación nos nosos estadios ou greens.
- Diagnóstico de enfermidades tanto en céspede sintomático como asintomático: tratamentos dirixidos e efectivos, evitando o uso de produtos de amplo espectro.
- Detección nun amplo rango (substrato, planta, auga, sementes).
- Detección e cuantificación de microorganismos antes e despois de realizar un tratamento con fitosanitarios, para comprobar a eficacia dos mesmos.
- Control de calidade de produtos formulados a base de microorganismos beneficiosos.
Diferenzas entre unha PCR e unha qPCR
Na técnica de PCR convencional, se se desexa comprobar se o ADN amplificou, e polo tanto se o microorganismo de interese está presente na mostra ou non, é necesario realizar outra técnica adicional denominada electroforese. Non obstante, aínda realizando a electroforese e comprobando que o ADN amplificou, en ningún momento é posible unha cuantificación do ADN que amplificamos, é dicir, non podemos saber se temos unha cantidade alta ou baixa do microorganismo que se quere analizar.
Existe unha versión da técnica de PCR, denominada PCR en tempo real ou qPCR, que permite, ademais de detectar a existencia destes microorganismos de forma precoz, a cuantificación dos mesmos en tempo real, de forma inmediata. Así pois, a técnica de qPCR presenta unha clara vantaxe fronte á PCR convencional, pois mediante esta podemos comprobar o nivel real de infección por parte dos microorganismos patoxénicos, e se a súa presenza no céspede é relevante ou non.
FUNCIONAMENTO DA qPCR
A qPCR é unha técnica que permite a duplicación do ADN a partir dunha pequena cantidade desta molécula, que se coñece como ADN molde. Este feito é posible grazas a unha enzima, a ADN polimerase. Esta técnica permite realizar un seguimento da amplificación do ADN grazas ao sinal producido por un marcador fluorescente unido a un dos compoñentes da reacción, que proporcionará un sinal de luz de intensidade proporcional á cantidade de ADN que se estea producindo. Así pois, canta máis cantidade de ADN haxa, maior cantidade de luz emitirá o marcador fluorescente.
O sinal emitido é interceptado por un software que recolle as lecturas nunha curva que representa todo o ciclo da reacción de amplificación.
Este equipo denomínase Termociclador e, como o seu nome indica, é o encargado de realizar os ciclos de temperatura necesarios para que se leve a cabo a reacción de amplificación do ADN. Os ciclos de temperatura fixados repítense unhas 40 veces, e en cada un deles suceden os seguintes pasos:
- 1ª parte do ciclo, temperatura de 95º. Desnaturalízase a molécula de ADN molde
- 2ª parte do ciclo, temperatura de 60º. Unión dos cebadores á molécula de ADN molde
- 3ª parte do ciclo, temperatura de 72º. A ADN polimerase elonga a cadea de ADN a partir dos cebadores que se uniron á cadea no paso anterior utilizando dNTPs.
A tecnoloxía de diagnose máis alta dispoñible para o teu campo.
En cada ciclo de temperatura realizado polo termociclador, prodúcese unha copia de cada unha das cadeas de ADN, de tal forma que se comezamos por unha nova molécula de ADN, obteremos 2 cadeas de ADN no 1º ciclo, 4 cadeas de ADN no 2º ciclo, 8 cadeas de ADN no 3º ciclo e así ata o último ciclo, onde teremos obtido millóns de cadeas de ADN.
Cando se produce unha amplificación de ADN nunha reacción de qPCR, é posible ver en tempo real como se vai producindo a duplicación das moléculas de ADN. Este feito prodúcese porque un dos compoñentes da reacción, a sonda, se atopa marcada cun composto fluorescente, que vai emitir luz unicamente cando se produza unha duplicación das cadeas de ADN. Deste xeito, cantas máis cadeas de ADN se dupliquen, maior luz emitirá o marcador, que será captada polos sensores do termociclador e finalmente interpretada polo software.
No momento en que se comeza a visualizar de forma significativa a luz xerada polo composto fluorescente (indicada polo software mediante unha curva), significa que se fixeron as suficientes copias de ADN do ADN molde como para que este poida ser detectado. Este momento coñécese como limiar de detección, o que quere dicir que a partir dese ciclo se produciu a detección de ADN molde. No caso de que o ADN molde proveña dun microorganismo, pódese dicir que se produciu a detección dese microorganismo.
Como interpreto a información proporcionada por unha qPCR?
A información que se obtén dunha reacción de qPCR varía dependendo do motivo polo cal se realizou a reacción.
No caso da detección de microorganismos patóxenos vexetais, a información que se está buscando é a detección de ditos patóxenos mediante o ADN. Tamén resulta de extrema utilidade coñecer a cantidade de microorganismo que está presente na mostra analizada.
No caso de que exista ADN do microorganismo buscado, durante a reacción de qPCR poderemos ver en tempo real se se produce duplicación do seu ADN grazas ao sinal emitido polo marcador fluorescente. Aparece así unha liña de amplificación exponencial no limiar de detección, que, como se dixo anteriormente, é o momento no que se pode dicir que existe presenza do microorganismo na mostra.
Se a detección se produce en pouco tempo, é dicir, en ciclos temperáns, significará que temos maior cantidade de microorganismos que se a detección se produce en ciclos tardíos. Este feito baséase en que, se se parte de maior número de copias de ADN, e polo tanto de maior cantidade de microorganismo, chegarase antes ás copias necesarias de ADN para que os sensores do termociclador poidan detectalas.
Tiloom xunto con Microgaia quere tecnificar o sector do céspede de uso deportivo e mediante o noso KIT PhytAlert Turf poderás dar un paso máis na sanidade vexetal.
