Kit de Fitodiagnose PCR. Diagnóstico de enfermidades do céspede mediante microscopía e reacción en cadea da polimerase (PCR)

Este artigo ofrece unha visión da metodoloxía de diagnóstico de enfermidades do céspede, no que se analiza a eficacia do Kit de Fitodiagnose PCR de Tiloom. No estudo analizouse raigrás perenne infectado dun campo deportivo do Leicester Football Club mediante microscopía e unha técnica molecular. O proceso iniciouse con inspeccións visuais en campo e microscopía, a análise concluíu mediante PCR cuantitativa en tempo real. Como resultado descartáronse 11 patóxenos comúns da estación fría, con catro identificacións positivas en varios niveis de infección, desde positivo débil ata forte. Os achados destes métodos analízanse a continuación.

Fondo da superficie do céspede deportivo. 

O céspede 100 % raigrás perenne que se estaba investigando cortouse varias veces por semana a 25 mm (reais). A semana anterior aplicouse arredor de 50 kg N/ha, 15 Kg P/ha, 45 kg K/ha cun aminoácido e algas. Este campo foi sometido a unhas 6 horas de adestramento de fútbol por semana.

Análise de microscopio

Un sitio para a infección. Lesión do cortacéspede en raigrás perenne desde o envés da folla.

Infección e morte regresiva da folla cortada de raigrás perenne baixo o microscopio de disección. As lesións causadas polo cortacéspede parecen ser un lugar de morte regresiva e infección. O ennegrecemento e a cor amarelenta indicaron signos de material foliar infectado.

Observáronse follas amarelentas e retorcidas en varias das follas de raigrás perenne inspeccionadas. Máis evidente foi a morte das follas desde a punta con estruturas de cor gris esbrancuxada nas follas moribundas, murchas e retorcidas do raigrás perenne.

Baixo un microscopio óptico, observáronse máis de preto as estruturas filamentosas.

Observouse unha infección bacteriana filamentosa tinguida con 40x para maior visibilidade dentro das follas de raigrás perenne.

Filamentos bacterianos tinguidos a 25x con azul de anilina para visualización dentro da folla de raigrás perenne. As bacterias filamentosas non se ramificaban e corrían lonxitudinalmente ao longo da folla. 

Bacterias filamentosas a 40x tinguidas con azul de anilina dentro dunha folla de raigrás perenne. As bacterias agregadas non se ramifican e non teñen tabiques aparentes (seccións/paredes divisorias).

Nunha planta diferente dentro da área mostrada, baixo un microscopio de disección, vese micelio algodonoso visible que sobresae do material das follas moribundas do raigrás perenne.

Hifas ramificadas, tinguidas de azul baixo microscopio óptico 25x

Hifas ramificadas tinguidas de azul dentro do raigrás perenne; desafortunadamente, observouse unha ramificación en forma de T lixeiramente desenfocada.

Resultados de microscopía

O traballo de microscopía óptica identificou unha infección bacteriana filamentosa potencialmente común, por exemplo, posiblemente signos tempranos dunha cianobacteria (infección por algas). Nunha planta diferente da mesma mostra, observouse máis de preto o micelio que sobresaía con ramificacións observables en forma de T. Característica de Rhizoctonia spp. Só con máis análises moleculares se podería dilucidar isto. 

Análise de ADN

A reacción en cadea da polimerase (PCR) é unha técnica molecular que se pode utilizar para detectar a presenza de ADN obxectivo. É moi preciso e a detección pode identificarse en cantidades moi pequenas. Agora utilizamos esta técnica para identificar a presenza de patóxenos de plantas/céspede. Estes patóxenos poden ser fúnxicos ou non fúnxicos (por exemplo, bacterianos). O modelo do ADN obxectivo (coñecido como cebador ou buffer) é necesario para a amplificación do ADN. Este método utiliza múltiples cebadores de ADN na PCR. Isto coñécese como PCR múltiple.

Os patóxenos de ADN analizados incluíron: Bipolaris spp., Clarireedia spp., Colletotrichum spp., Drechslera spp., Fusarium poae , Gaeumannomyces spp., Laetisaria fuciformis , Microdochium nivale , Pyricularia grisea , Pythium spp., Rhizoctonia cerealis , R. solani , Sclerophthora macrospora. , Xanthomonas translucens , Labyrinthula spp. 

Ou comunmente coñecido como: Leaf spot (Bipolaris & Dreschlera spp), dollar spot, antracnose, Fusarium, take-all patch, red thread (fío vermello), Microdochium patch, grey leaf spot, Pythium (damping off), yellow patch, brown patch, yellow tuft (mildio velloso), bacterial wilt (murchamento bacteriano), Rapid blight(tizón rápido). 

Tomáronse mostras de seis plantas de raigrás perenne e prepuxéronse para análises forenses adicionais mediante reacción en cadea da polimerase (PCR).

O material de follas, brotes e raíces do raigrás perenne cortouse e homoxeneizouse para a súa análise.

O paso inicial da extracción de ADN foi a descomposición das células do material de follas, brotes e raíces.

A planta extraída e o concentrado de ADN patóxeno.

O ADN extraído lavouse e eluíuse en preparación para a amplificación do ADN mediante PCR

Microtubos que conteñen solución de reacción de PCR para os 15 patóxenos con control de amplificación.

Detectáronse positivamente catro patóxenos mediante PCR cuantitativa en tempo real: Microdochium nivale (Fusarium patch), Pythium spp. (damping off), Rhizoctonia solani (brown patch) e R. cerealis (Yellow Patch). Detectouse un nivel elevado de R. cerealis.

Resultados da PCR

Como o ADN analizado aquí non incluía Cyanobacteria spp. non foi posible confirmar a súa presenza. Con todo, esta técnica de PCR múltiple descartou outros 11 patóxenos do céspede mostrado. Aínda que non houbo síntomas obvios de enfermidade que puidesen estar asociados con Microdochium/Fusarium Patch ( Microdochium nivale ) ou Pythium , observáronse mediante microscopía hifas características de Yellow Patch ( Rhizoctonia cerealis ) ou Brown Patch ( R. solani ) no momento da mostraxe. A análise de ADN proporcionou evidencia da súa presenza. Curiosamente, sospeitábase que a enfermidade de Yellow Patch era a causa das manchas no verán e no outono anteriores (xullo-outubro) de 2021 e 2023. Sábese que a rizoctonia pasa o inverno dentro do céspede ou os restos de plantas. Como o raigrás mostrado incluía follas, raíces, brotes e material descomposto das follas, é probable que na reacción se incluísen fungos que pasaron o inverno.

Síntomas típicos de infección pola mancha amarela que ocorren nos meses de verán de 2022 e 2023 (esta foto é de agosto de 2023) no sitio.

Recomendacións

É importante sinalar que se identificaron múltiples patóxenos nestas mostras. Normalmente, nomeamos e discutimos unha enfermidade cando observamos signos e síntomas no céspede. Neste caso interveñen polo menos catro ou cinco axentes patóxenos. Os patóxenos identificados poden ter causado o amarelecemento e a morte regresiva cunha infección bacteriana secundaria. Posiblemente, isto sexa típico, e a interacción entre estes patóxenos e outros trastornos como as algas está tendo un efecto combinado na condición do céspede; isto probablemente requira máis investigación.

As recomendacións para controlar estas ameazas á saúde e condición do céspede incluirían a revisión de enfoques biolóxicos e físicos. Por exemplo, sábese que certas especies de bacterias Bacillus controlan Rhizoctonia . Hai unha gama de produtos dispoñibles no mercado do céspede. A intervención temperá neste momento pode ter unha maior eficacia, como é habitual nos controis biolóxicos. Para a infección por cianobacterias realízase unha aplicación secuencial de luz UV-C, baixo a premisa de que as algas son sensibles aos raios UV. Tamén poderán revisarse a aplicación e a dose de nitróxeno e fósforo, co fin de garantir niveis suficientes. 

O diagnóstico de enfermidades do céspede é un paso importante no manexo eficiente e eficaz do céspede. Xa sexa asignando recursos e orzamento, ou actuando de maneira eficiente e efectiva para protexer o medio ambiente e ao mesmo tempo manter superficies de xogo de calidade. Sabemos que o manexo preventivo de enfermidades adoita ser rendible e facilita superficies de xogo de boa calidade. 

Se ben a microscopía permitiu unha investigación ampla da infección, non puido identificar o axente patóxeno exacto. A inspección microscópica foi unha oportunidade para investigar os sitios de infección e observar calquera característica do fungo patóxeno, como se mostra coas follas cortadas danadas polo cortacéspede e o inicio da infección. Este foi un paso inicial importante cara á investigación dunha causa probable, no caso de que se requira unha identificación precisa. 

A técnica de PCR foi precisa na detección de patóxenos presentes, xa fose que estes patóxenos estivesen infectando o céspede de maneira sintomática ou latente. É posible que proporcionase un indicador case preditivo de posibles enfermidades futuras. Isto significa que se pode iniciar e monitorizar continuamente un plan integrado de tratamentos para estes patóxenos específicos. 

A mellor forma de diagnosticar a identificación precisa de patóxenos na fase sintomática ou inactiva é utilizando microscopía e análise molecular, como se mostra neste estudo de caso. É probable que estas técnicas brinden ao greenkeeper a mellor información para tomar medidas inmediatas e planificar o manexo de enfermidades. En esencia, estes parecen ser os mellores primeiros pasos para unha xestión integrada de enfermidades proactiva e preventiva.

Contacte con Tiloom en info@tiloom.com e en menos de 48 horas terá a resposta a través dunha análise de diagnóstico qPCR.