Anàlisi de sòl i microorganismes
FOTO · TILOOM
El creixent interès per la microbiologia del sòl es deu a la contribució dels microorganismes a la productivitat i sostenibilitat agrícola. La conscienciació d'investigadors, productors rurals i empreses d'insums biològics sobre la importància de l'activitat biològica per a l'agricultura ha influït en la creació i adaptació de tècniques i eines que permeten ampliar el coneixement
sobre els microorganismes.
ETAPA 1. Extracció d'ADN i preparació de biblioteques.
- L'extracció d'ADN es realitza amb el kit DNeasy PowerLyzer PowerSoil de Qiagen (Hilden, Alemanya).
- BeCrop utilitza cebadors personalitzats per a l'amplificació per PCR dirigits específicament a la regió 16S rRNA V4 i la regió ITS1.
- Els amplicons es purifiquen utilitzant el kit KAPA Pure Beads (Roche, Basilea, Suïssa), mentre que l'amplificació correcta de 16S i ITS s'avalua utilitzant gel d'agarosa.
- Els productes de PCR purificats se sotmeten després a la preparació de la biblioteca, seguint un protocol de PCR Illumina de dos passos.
- A continuació, es quantifica l'ADN utilitzant un fluoròmetre Qubit amb el kit d'assaig Qubit HS 500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA).
- Finalment, les biblioteques es seqüencien en un instrument Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, CA, EUA) utilitzant 2 × 251 lectures d'extrems aparellats.
ETAPA 2. Processament bioinformàtic
- Els cebadors s'eliminen de les lectures de parells utilitzant Cutadapt.
- Després, les lectures retallades es fusionen amb una superposició mínima de 100 nucleòtids.
- A continuació, les seqüències es filtren per qualitat utilitzant l'error esperat amb un valor màxim d'1,0.
- Després d'un preprocessament de qualitat, les lectures amb diferències d'un sol nucleòtid s'agrupen iterativament per formar ASV (variants de seqüenciació d'amplicons) utilitzant Swarm.
- Posteriorment s'eliminen les quimeres de novo i els singletons restants.
- Finalment, la taxonomia s'assigna a partir d'ASV utilitzant un alineament global amb una identitat del 97% enfront d'una base de dades de referència curada de SILVA 138.1 per a seqüències 16S i UNITE 8.3 per a seqüències ITS.
ETAPA 3. Càlcul d'índexs de microbiomes i propietats de xarxa.
Les propietats de la xarxa local es determinen seguint el procediment descrit per Ortiz-Alvarez et al:
- Es construeixen xarxes comunitàries microbianes per a mostres 16S i ITS de manera independent seguint la metodologia informada en una publicació anterior.
- La meta-xarxa de presència-absència amb totes les mostres es construeix utilitzant recomptes enrarits i els parells ASV, que es produeixen amb una freqüència significativament major o menor que l'esperada, es van preservar i es va determinar la xarxa de coocurrència o coexclusió, respectivament.
- Les propietats de la xarxa local per als dos marcadors es calculen tant per a la coocurrència com per a la coexclusió: modularitat, transitivitat i longitud mitjana del camí.
- La modularitat descriu la separació entre grups de microorganismes (mòduls) que tendeixen a coexistir o excloure's amb freqüència en nínxols ecològics específics.
- La transitivitat (coeficient d'agrupament) mesura la tendència dels nodes connectats a formar triangles tancats.
- La longitud mitjana del camí quantifica el grau de connectivitat per anar d'un costat de la xarxa a un altre.
Els índexs BeCrop són indicadors utilitzats per avaluar l'estat de salut dels sòls basant-se en dades metagenòmiques tal com ho descriuen Acedo et al. Aquests indicadors avaluen trets rellevants relacionats amb la salut del sòl que van des del potencial metabòlic fins al biocontrol i les estimacions hormonals.
Les bases de dades subjacents infereixen l'adaptació a l'estrès basant-se en diversos mecanismes: àcid abscísic (ABA), 1-aminociclopropà-1-carboxilat (ACC) desaminasa, producció d'exopolisacàrids (EPS), solubilització de metalls pesants, àcid salicílic, tolerància a la sal i producció de sideròfors.
A més, ofereixen una producció potencial d'hormones basada en la producció de citoquinines, giberel·lina i IAA. Totes les abundàncies de mecanismes potencials es basen en la combinació d'abundàncies de procariotes i fongs rellevants i s'escalen a un índex d'1 a 6, on 1 indica baixa abundància i 6 indica alta abundància a la mostra de sòl respectiva.
No dubtis a contactar amb Tiloom Soluciones Tecnológicas per fer un d'aquests tests i donar un impuls definitiu al teu producte.
